2019年6月11日，福建師范大學(xué)歐陽(yáng)松應(yīng)團(tuán)隊(duì)在Nature Communications 在線發(fā)表題為“Two HEPN domains dictate CRISPR RNA maturation and target cleavage in Cas13d”的研究論文，該研究為進(jìn)一步改造Cas13d蛋白作為核酸編輯及檢測(cè)工具，提供了扎實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)；
2018年11月13日，福建師范大學(xué)歐陽(yáng)松應(yīng)團(tuán)隊(duì)在Cell Research 在線發(fā)表“Structural insights into Cas13b-guided CRISPR RNA maturation and recognition”，該成果對(duì)認(rèn)識(shí)與理解細(xì)菌抵抗RNA病毒入侵的分子基礎(chǔ)具有重要意義，為改造CRISPR-Cas13b系統(tǒng)其在RNA識(shí)別與編輯、核酸檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)；
2018年7月1日，福建師范大學(xué)歐陽(yáng)松應(yīng)等團(tuán)隊(duì)在Structure上在線發(fā)表了題為“Crystal Structure of ATP-Bound Human ABCF1 Demonstrates a Unique Conformation of ABC Proteins”的研究論文，該研究分析了一個(gè)結(jié)合ATP的野生型人源ABCF 1的晶體結(jié)構(gòu)（2.3-Å分辨率）。比較研究表明，該結(jié)構(gòu)為預(yù)激活中間構(gòu)象。這種構(gòu)象是通過ATP與蛋白質(zhì)的相互作用來穩(wěn)定的。同時(shí)該研究也表明，這種構(gòu)象是激活A(yù)BCF 1的一個(gè)重要步驟。本研究從分子水平擴(kuò)展了我們對(duì)ABC蛋白激活的理解。
嗜肺軍團(tuán)菌是一種引起肺炎的不典型致病菌，其引起的重癥肺炎俗稱“空調(diào)肺”。該菌能通過IV型分泌系統(tǒng)Dot/Icm分泌300多個(gè)效應(yīng)蛋白到宿主細(xì)胞中，調(diào)控干擾宿主各種信號(hào)通路以輔助其自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖。對(duì)這些效應(yīng)蛋白的功能解析不僅有助于闡明了嗜肺軍團(tuán)菌侵染宿主的分子機(jī)理，同時(shí)也能揭示新的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方式和蛋白質(zhì)翻譯后修飾模式【2】。眾所周知，泛素化修飾幾乎調(diào)控真核細(xì)胞的生命活動(dòng)的所有方面3。在與宿主的長(zhǎng)期博弈過程中，病原菌進(jìn)化出了多種方式來干預(yù)宿主的泛素修飾系統(tǒng)，從而達(dá)到增強(qiáng)侵染效率和逃避宿主免疫監(jiān)視的目的。2016年普渡大學(xué)羅招慶教授課題組在《Nature》雜志上首次報(bào)道了SidE家族效應(yīng)蛋白獨(dú)立于經(jīng)典的E1和E2酶的泛素化修飾的重大發(fā)現(xiàn)【4】，引發(fā)了廣泛關(guān)注【5-7】，該發(fā)現(xiàn)入選為當(dāng)年度細(xì)胞信號(hào)傳遞領(lǐng)域的重大突破之一【8】。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌中的另一個(gè)效應(yīng)蛋白SidJ可調(diào)控SdeA等SidE家族成員【9】，但其生化機(jī)制尚未清楚。
針對(duì)這一重要科學(xué)問題，中美兩國(guó)研究人員進(jìn)行了聯(lián)合攻關(guān)。首先，通過質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析，發(fā)現(xiàn)SidJ誘導(dǎo)失活的SdeA發(fā)生129.01道爾頓的分子量漂移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SidJ能對(duì)SdeA進(jìn)行谷氨酸化修飾，且 SdeA 被修飾的位點(diǎn)是位于其mART結(jié)構(gòu)域中860位的谷氨酸殘基上，該位點(diǎn)是SdeAmART結(jié)構(gòu)域催化的活性位點(diǎn)之一，主要負(fù)責(zé)水解NAD＋，為泛素激活提供能量。更為有趣的是，研究者通過對(duì)SidJ序列分析，發(fā)現(xiàn)SidJ的C端具有一個(gè)結(jié)合CaM的保守IQ 結(jié)構(gòu)域，CaM與SidJ結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，進(jìn)而激活其酶活性（圖1）。
圖1 SidJ通過C端I841Q842 motif與CaM結(jié)合從而谷氨酸化SdeA
隨后研究人員解析了SidJ-CaM二元復(fù)合物以及SidJ-CaM結(jié)合AMP的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（圖2），驚奇地發(fā)現(xiàn)SidJ的結(jié)構(gòu)與在已知的真核生物中行使谷氨酸化修飾功能的tyrosine ligase-like（TTLL）家族酶完全不同【10】。結(jié)構(gòu)解析顯示CaM能夠通過N-lobe和C-lobe與SidJ存在廣泛的結(jié)合。
SidJ-CaM（PDB：6K4K）以及SidJ-CaM-AMP（PDB：6K4R）的晶體結(jié)構(gòu)及不同的ATP類似小分子對(duì)其激活的能力
另外，SidJ-CaM 復(fù)合體結(jié)合一個(gè)AMP殘基，揭示SidJ是在a位磷酸切割A(yù)TP，從而通過?；瘑瘟姿嵯佘栈せ畋恍揎椢稽c(diǎn)的谷氨酸殘基，異于常見的磷酸化激活。因此，g 位不能水解的類ATP分子仍能支持其活性。同時(shí)，在沒有SdeA的反應(yīng)體系里，SidJ能發(fā)生AMP自修飾（self-AMPylation），進(jìn)一步說明該反應(yīng)由兩步特異的修飾完成（圖2）。在沒有受體基團(tuán)的條件下，SidJ將源于ATP的AMP用于自修飾。綜合現(xiàn)有的研究結(jié)果，研究人員提出了SidJ結(jié)合宿主CaM催化SdeA的谷氨酸化修飾，進(jìn)而導(dǎo)致SdeA失活的分子機(jī)制（圖3）。
圖3 SidJ-CaM通過形成酰化單磷酸腺苷反應(yīng)中間物催化谷氨酸化的反應(yīng)模型。
谷氨酸化修飾此前多見于真核細(xì)胞微管蛋白（Tubulin）的修飾，并調(diào)控多種重要細(xì)胞功能，但是其催化機(jī)理如底物識(shí)別等機(jī)制并不是非常清楚【10,11】。SidJ作為一個(gè)CaM依賴的谷氨酸化酶為進(jìn)一步探討這一家族酶的作用機(jī)制提供了一個(gè)窗口。該工作是由美國(guó)普渡大學(xué)羅招慶教授課題組和福建師范大學(xué)歐陽(yáng)松應(yīng)教授課題組合作完成的。羅招慶教授和歐陽(yáng)松應(yīng)教授為本文的共同通訊作者，普渡大學(xué)羅招慶教授課題組博士生干寧海、福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院青年教師甄向凱博士、普渡大學(xué)劉堯、以及福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心一年級(jí)碩士生許小龍為共同第一作者。
據(jù)悉，《Nature》同期還以背靠背的方式刊登了德國(guó)歌德大學(xué)（Goethe University）Ivan Dikic教授課題組的研究論文“Inhibition of SidE ubiquitin ligases throughSidJ/Calmodulin catalyzed glutamylation”【12】。美國(guó)西南醫(yī)學(xué)中心的研究人員在《Science》上也發(fā)表了類似的研究結(jié)果【13】。
