今年1月10日，施一公教授團(tuán)隊在另一頂級學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》（Science）發(fā)表了該領(lǐng)域的又一重要研究成果，拉開了2019年我國生命科學(xué)領(lǐng)域研究的序幕。

近年來，施一公教授及其所帶領(lǐng)的團(tuán)隊一直將揭示阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理作為重點(diǎn)研究方向，經(jīng)過長期不懈的努力，取得一系列重要突破。研讀間第一時間聯(lián)系了兩篇論文的共同第一作者，生命學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者楊光輝，為我們講述了研究過程背后鮮為人知的故事。

「雙殺」：連發(fā)兩篇頂級期刊

2018年12月31日和2019年1月10日，清華大學(xué)施一公教授研究團(tuán)隊分別于頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）和《科學(xué)》（Science）發(fā)表兩篇與阿爾茲海默癥關(guān)鍵蛋白作用機(jī)制相關(guān)的研究成果，《人源γ-分泌酶識別底物Notch的結(jié)構(gòu)機(jī)制》（Structural Basis of Notch Recognition by Human γ-secretase）和《人源γ-分泌酶底物淀粉樣前體蛋白的識別》（Recognition of Amyloid Precursor Protein by Human γ-secretase）的文章，完成了跨年「雙殺」。兩篇文章報道了人體γ-分泌酶結(jié)合底物Notch以及和淀粉樣前體蛋白（APP）的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，從分子層面為理解γ-分泌酶特異性識別和底物切割的機(jī)制提供了重要認(rèn)知基礎(chǔ)，為研究與阿爾茲海默癥以及癌癥相關(guān)的發(fā)病機(jī)制、特異性藥物設(shè)計提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。

突破：提供「狙擊式」?jié)撛谥委煼桨?/span>

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s Disease, AD）是當(dāng)今世界面臨的最為嚴(yán)峻的神經(jīng)退行性疾病。主要臨床表現(xiàn)為腦組織切片中出現(xiàn)淀粉樣斑塊、神經(jīng)元死亡、認(rèn)知和記憶能力受損，最終腦功能嚴(yán)重受損直至死亡。統(tǒng)計結(jié)果表明，在65歲以上人群中，其發(fā)病率高達(dá)10%，在85歲以上人群中，發(fā)病率更是達(dá)到30-50%；我國目前患該病的人口高達(dá)500萬，約占世界患者總數(shù)的四分之一，并且由于世界范圍內(nèi)預(yù)防治療手段不足、缺乏特效藥物，該疾病有發(fā)病年齡提前、發(fā)病人數(shù)增加的趨勢，給病人及家屬造成極大痛苦，也同時為社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。

阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理尚不明確。病人腦組織中的淀粉樣斑塊，是由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）被酶切割產(chǎn)生的短肽聚集而來。除了淀粉樣蛋白，重要的信號蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的異常切割會導(dǎo)致發(fā)育的異常，與一些諸如T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病在內(nèi)的癌癥發(fā)病也有重要聯(lián)系。

「如果把底物Notch或者APP比喻成一根繩子，那么γ-分泌酶的作用就是要把這根繩子剪成一段一段。如果切割產(chǎn)生異常，或者這些剪出來的小段纏繞在一起就有可能導(dǎo)致疾病?！勾送猓缸鳛榕c阿爾茲海默癥和癌癥均緊密相關(guān)的蛋白，很多藥物的研發(fā)直接以γ-分泌酶作為靶點(diǎn)，希望通過調(diào)節(jié)其活性來治療相關(guān)疾病。」

近年來，多種旨在減少淀粉樣沉淀的γ-分泌酶活性抑制劑的臨床實(shí)驗(yàn)均宣告失敗，較為著名的是禮來公司臨床實(shí)驗(yàn)的Semagacestat。這一抑制劑雖然能夠減少淀粉樣沉淀，但并不能改善患者的認(rèn)知狀況，更嚴(yán)重的是由于同時抑制了γ-分泌酶對Notch的切割，導(dǎo)致患者罹患癌癥的風(fēng)險大幅增加，最終該臨床實(shí)驗(yàn)提前終止，而對γ-分泌酶結(jié)合底物機(jī)制研究的缺失是造成這一失敗的原因之一。基于此，獲得γ-分泌酶與底物Notch以及APP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，對研究γ-分泌酶的底物識別酶切機(jī)理和以γ-分泌酶為靶標(biāo)的特異性藥物設(shè)計具有極大科學(xué)意義和潛在應(yīng)用價值。

研究團(tuán)隊認(rèn)為，這或許為開發(fā)底物特異性的抑制劑帶來啟發(fā)。類似于從「霰彈槍」到「狙擊槍」的過度，未來可以開發(fā)特異地抑制β淀粉樣前體蛋白APP的加工而不影響Notch加工的藥物，靶向治療阿爾茲海默癥且不導(dǎo)致副作用。與此同時，這兩篇文章通過細(xì)節(jié)方法的創(chuàng)新，首次揭示了膜內(nèi)蛋白水解酶與底物復(fù)合體這一大類的結(jié)構(gòu)信息。

科研：挑戰(zhàn)與驚喜并存

研讀間第一時間聯(lián)系了兩篇論文的共同第一作者，生命學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者楊光輝，為我們講述了研究過程背后鮮為人知的故事。

Q1：在研究過程中有什么曲折的經(jīng)歷？

有的。課題難度很大，最難的點(diǎn)在于獲得穩(wěn)定的酶和底物的復(fù)合體，這一狀態(tài)很難捕捉。我們前期在蛋白質(zhì)設(shè)計上做了很多工作，直到最后采用了文章里描述的交聯(lián)的辦法。

Q2：研究過程中有什么印象特別深刻的事嗎？

印象深刻的事很多。施老師實(shí)驗(yàn)室一直在做γ分泌酶相關(guān)的工作，我自己也一直在思考如何解析γ分泌酶與底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)。很早就在思考，但是初期各種蛋白質(zhì)設(shè)計的方法并不能獲得酶和底物穩(wěn)定在一起的狀態(tài)。

在讀文獻(xiàn)的過程中看到了酶與底物可能發(fā)生相互作用的部分位點(diǎn)，有了一些線索。從2017年初想到并開始嘗試使用交聯(lián)的方法，然而也不知道哪幾個氨基酸位點(diǎn)能交聯(lián)在一起，于是就在有限的線索下進(jìn)行嘗試，希望能夠篩選出最優(yōu)解。我們最終成功獲得了這個解答，并且獲得了Notch與γ分泌酶在一起的狀態(tài)，這時已經(jīng)快到春節(jié)了。

我們立即收了一些數(shù)據(jù)，春節(jié)在家遠(yuǎn)程計算，大年初三早上我算出來一個初步結(jié)果，發(fā)現(xiàn)我們想要的底物確實(shí)存在。很興奮！有一種迫不及待想把課題做出來的心情。于是我們很快回到實(shí)驗(yàn)室，準(zhǔn)備樣品，收集數(shù)據(jù)，最終把課題做了出來。

還有一個印象深刻的事情就是課題做出來后，我們從結(jié)構(gòu)里發(fā)現(xiàn)了一個沒有想象到的二級結(jié)構(gòu)β-sheet的形成。如果沒有結(jié)構(gòu)生物學(xué)，是很難想象或者預(yù)測出來的。這也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)巨大的魅力。

Q3：如何在這么短的時間內(nèi)連續(xù)在頂刊發(fā)表兩篇論文？

APP和Notch對研究阿爾茲海默綜合癥的發(fā)病機(jī)理和治療手段都很重要。很多藥物公司投入巨資研發(fā)減少APP切割的藥物，其中禮來公司的Semegacestat就是一種γ-分泌酶的抑制劑，這一款被寄予厚望的藥物臨床實(shí)驗(yàn)中確實(shí)減少了淀粉樣蛋白的量，但是也增加了病人患癌的風(fēng)險，原因就是藥物抑制了Notch的切割。所以設(shè)計出特異性的只針對性抑制APP切割的藥物非常重要，我們對這方面很感興趣。基于此，要想更全面的解決特異性的問題，我們需要獲得γ-分泌酶分別結(jié)合APP和Notch的結(jié)構(gòu)。

其實(shí)兩種底物的研究過程是螺旋上升的，一直同時進(jìn)行。在最初的對APP的嘗試中，由于APP蛋白本身的性質(zhì)，我們并沒有獲得很大突破。隨后我們比較了Notch與APP的蛋白質(zhì)序列，驚奇的發(fā)現(xiàn)盡管二者序列各不相同，但是二級結(jié)構(gòu)相似性很大。這一規(guī)律的總結(jié)帶給我們突破口。我們先獲得了Notch與γ-分泌酶的穩(wěn)定復(fù)合物，隨后在解析結(jié)構(gòu)后再次對比APP與Notch的序列，確定了針對APP的方案，真是有一種柳暗花明的感覺。

此外，楊光輝就研究生科研也提出了一些自己的心得和建議。他認(rèn)為做研究的目的是解釋這個領(lǐng)域的重要的科學(xué)問題。同時他認(rèn)為，要想更好地做研究，這個領(lǐng)域的文章一定要多讀，重要的文章細(xì)讀，從中多總結(jié)；同時要有批判性思維，對重要的線索要先驗(yàn)證，再與自己的課題相結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)過程中一定要注意細(xì)節(jié)的把握，做好對照實(shí)驗(yàn)，要注重實(shí)驗(yàn)設(shè)計的邏輯。

十年求索：愈加清晰的研究視野

施一公教授2006年在清華大學(xué)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室之初，就將揭示阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理作為重點(diǎn)研究方向。此次發(fā)表的兩篇研究成果是研究團(tuán)隊長期以來在該領(lǐng)域持續(xù)發(fā)力的重要結(jié)晶。在此之前，施一公教授及其所帶領(lǐng)的團(tuán)隊在該領(lǐng)域不斷突破，發(fā)表了一系列重要研究成果：

2012年12月，施一公研究組在《自然》（Nature）報道PS1細(xì)菌同源蛋白PSH的晶體結(jié)構(gòu)，并根據(jù)同源性首次構(gòu)建了PS1的結(jié)構(gòu)模型，揭示了PS1的結(jié)構(gòu)折疊，并在結(jié)構(gòu)上初步分析了在阿爾茲海默癥病人中發(fā)現(xiàn)的PS1突變位點(diǎn)。

2014年6月，施一公研究組與英國MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室白曉晨博士等合作在《自然》（Nature）報道了分辨率為4.5埃的γ-分泌酶復(fù)合物電鏡結(jié)構(gòu)，觀察到了其跨膜區(qū)域呈馬蹄形排布的結(jié)構(gòu)。

2014年9月，施一公研究組在《美國科學(xué)院院刊》（PNAS）發(fā)表文章，報道了其中一個亞基Nicastrin同源蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，推測了Nicastrin在底物招募過程中可能的機(jī)制，并且根據(jù)同源性構(gòu)建了人源Nicastrin 胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，結(jié)合該結(jié)構(gòu)與此前解析的PSH晶體結(jié)構(gòu)和4.5埃分辨率電鏡結(jié)構(gòu)，他們在γ-分泌酶跨膜區(qū)辨認(rèn)出了PS1，并進(jìn)一步推測了該復(fù)合物近20個跨膜螺旋的組裝模式。

2015年3月，施一公研究組在《美國科學(xué)院院刊》（PNAS）發(fā)表論文，報道PS1的細(xì)菌同源蛋白PSH具有與γ-分泌酶類似的底物切割活性，并且其酶活也受到γ-分泌酶小分子抑制劑的抑制，并解析了該抑制劑與PSH的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示了其抑制位點(diǎn)，從而使得PSH可以作為一個研究成本相對低廉的替代品來進(jìn)行γ-分泌酶調(diào)控小分子的初步篩選。

2015年4月，施一公研究組在《美國科學(xué)院院刊》（PNAS）發(fā)表論文，報道人源γ-分泌酶4.3埃的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)。與一年之前的4.5埃結(jié)構(gòu)相比，盡管分辨率只提高0.2埃，但是跨膜區(qū)密度質(zhì)量有了極大提高。此外他們在PS1的N端連接T4-溶菌酶蛋白，從而準(zhǔn)確定位出PS1的第一個跨膜螺旋，并在此基礎(chǔ)上判斷出四個亞基，驗(yàn)證了在2014年P(guān)NAS文章中推測的組裝方式。此外，他們利用性質(zhì)非常緩和的去污劑制備樣品，證明電鏡觀察到的結(jié)構(gòu)并未因蛋白純化和冷凍制備而受到影響。這個結(jié)構(gòu)也是清華大學(xué)電鏡平臺的K2電子探測相機(jī)自2014年暑期正常運(yùn)轉(zhuǎn)之后解析出的最小分子量的結(jié)構(gòu)。

2015年8月18日，施一公研究組在《自然》（Nature）在線發(fā)表了題為《人源γ-分泌酶的原子分辨率結(jié)構(gòu)》（An Atomic Structure of Human γ-secretase）的文章，報道了分辨率高達(dá)3.4埃的人體γ-分泌酶的電鏡結(jié)構(gòu)，并且基于結(jié)構(gòu)分析研究了γ-分泌酶致病突變體的功能，為理解γ-分泌酶的工作機(jī)制以及阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理提供了重要基礎(chǔ)。

2017年，施一公研究組于《美國科學(xué)院院刊》（PNAS）發(fā)表兩篇文章，對γ-分泌酶上疾病相關(guān)突變切割A(yù)PP的性質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行了研究。