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病理實驗技術(shù)

   2018-06-19 現(xiàn)代實驗室裝備網(wǎng)1329
核心提示:病理學(xué)技術(shù)(組織標(biāo)本切片和染色技術(shù))是組織學(xué)、病理學(xué)等學(xué)科用于觀察和研究組織與細(xì)胞的正常形態(tài)及病理變化的常用方法。
        1、 什么是病理學(xué)實驗技術(shù)? 

 

病理學(xué)技術(shù)(組織標(biāo)本切片和染色技術(shù))是組織學(xué)、病理學(xué)等學(xué)科用于觀察和研究組織與細(xì)胞的正常形態(tài)及病理變化的常用方法。 

 

2、 什么是組織制片技術(shù)及其目的? 

 

組織經(jīng)過固定、切片和染色后,光波通過被檢組織成分時,波長和振幅發(fā)生改變,在顯微鏡下能清晰的觀察其組織結(jié)構(gòu),稱之為光鏡標(biāo)本的基本制作方法或稱為組織制片技術(shù)。 

 

目的生物學(xué)標(biāo)本在生活狀態(tài)下多為無色透明,而且組織一旦離開機(jī)體后很快就會死亡,其結(jié)構(gòu)就會失去正常狀態(tài)。必須對組織采取固定、切片和染色措施! 

 

3、 組織非切片制片方法有哪些? 

 

(1)組織分離標(biāo)本 

 

(2)組織活體標(biāo)本 

 

(3)組織涂片標(biāo)本

 

(4).磨片標(biāo)本

 

(5)整體封存(壓片)標(biāo)本

 

(6)組織鋪片標(biāo)本

 

(7)組織印片標(biāo)本等 

 

4、 根據(jù)所使用支持物質(zhì)的不同,組織切片方法分為哪些種類?組織切片的主要程序。  

 

根據(jù)所使用支持物質(zhì)的不同,切片方法分為:

 

(1)石蠟切片法

 

(2)火棉膠切片法

 

(3)冰凍切片法

 

(4)超薄切片法(電鏡技術(shù))

 

(5)樹脂切片

 

(6)碳蠟切片 


組織切片的主要程序: 

 

取材、固定→脫水→透明、浸透→包埋、切片→貼片、染色→浸洗→脫水→透明→封固。 

 

5、 標(biāo)本主要來源及取材的要求、取材主要注意事項? 

 

來源:臨床活體檢查,手術(shù)切除,病理解剖,實驗動物等 

 

要求:

 

(1)根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵蠹安∽兂潭群侠砣〉媒M織材料。

 

(2)取材的過程迅速、準(zhǔn)確 

 

組織取材注意事項

 

材料保持新鮮、標(biāo)本大小適宜、勿使組織塊受擠壓、盡量保持組織的原有形態(tài)、選好標(biāo)本切面、保持材料的清潔、切除不需要部分、明確編號,登記 

 

6、 何謂固定,固定的目的及主要方法有哪些?影響固定的因素及注意事項。常用固定液有哪些。 

 

標(biāo)本(組織)固定是指從人體內(nèi)或動物體內(nèi)取下的材料立即浸泡在化學(xué)試劑中,借助化學(xué)試劑的作用,將組織 細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存起來,使其形態(tài)結(jié)構(gòu)近似生活狀態(tài)的一種手段。 

 

固定的目的: 

 

1)防止標(biāo)本的自溶與腐敗,以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。 

 

2)使組織細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種物質(zhì)成份沉淀或凝固成不溶性物質(zhì),以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。 

 

3)可增強(qiáng)染色的作用。使組織中的各種物質(zhì)沉淀凝固而產(chǎn)生不同的折射率,造成光學(xué)上的差異,以便染色后易于鑒別和觀察。 

 

4)固定劑兼有硬化作用,使組織硬化,增加組織硬度,便于制片。 

 

5)防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。另外,對某些具有傳染性的標(biāo)本,能防止疾病的擴(kuò)散。

 

固定的方法: 

 

物理方法 干燥:血涂片  高熱:細(xì)菌涂片  低溫驟冷 

 

化學(xué)方法  使用化學(xué)試劑配制成固定液固定 

 

影響固定的因素:

 

1 .組織固定必須新鮮:無論取人體或動物組織,都必須立即投入固定劑。

 

2.防止組織因固定劑的作用而發(fā)生變形:

 

3.標(biāo)本大小:在保證形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的同時,厚度不超過5mm。

 

4.固定液的量:一般為組織塊體積的20-30倍(不得少于標(biāo)本體積的5倍)。

 

5.固定時間:根據(jù)組織的種類、大小,固定劑種類、性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱而定。

 

6.固定溫度:室溫(20-25℃)或低溫(如4℃),一般不應(yīng)超過40-45 ℃。

 

7.選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?/p>

 

8.促使固定 

 

注意事項:免疫組化固定方法的原則是:在保持細(xì)胞形態(tài)完好和所測抗原的前提下,應(yīng)選用濃度最低的固定液和最短的固定時間。為此,固定組織時應(yīng)該: 

 

1)組織新鮮,盡早、盡快固定。

 

2)組織塊盡量小。

 

3)固定后充分水洗,減少固定液造成的人工假象。 

 

4)針對抗原、染色法選擇最佳的固定方法 。 

 

常用的固定劑: 

 

1)10%福爾馬林緩沖液(pH7.4)

 

2)4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)

 

 3)Bouin液 

 

4)Zamboni’s液 

 

 5)丙酮  

 

6)95%乙醇  

 

7)A-F液 

 

7.何謂脫水,脫水的目的、常用脫水劑及脫水注意事項。 

 

定義:利用某種化學(xué)試劑逐步將標(biāo)本內(nèi)部吸收的水分置換出來,以使標(biāo)本處于無水狀態(tài),這一過程叫脫水。 目的和原則1有利于標(biāo)本的下一步處理,即透明、浸透、包埋 2有利于切片的操作 3有利于標(biāo)本的長久保存 

 

常用的脫水劑:1.單純脫水劑:如乙醇、丙酮和甲醇 2.脫水兼透明劑:如正丁醇、叔丁醇等 

 

注意事項:脫水時必須由低濃度脫水劑開始,逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑,經(jīng)過各級濃度的脫水劑使其所含的水分逐漸減少而代之以脫水劑。防止組織過度收縮變形,或脫水不完全而影響制片效果。 

 

8.石蠟包埋程序 

 

1)組織取材3mm厚度,固定于福爾馬林?jǐn)?shù)小時后再換以新鮮福爾馬林固定數(shù)小時。

 

2)組織流水沖洗6-12h。 

 

3)70%酒精2-4h。

 

4)80%酒精2-4h。

 

5)90%酒精2-4h。

 

6)95%酒精(Ⅰ、Ⅱ)2-4h。

 

7)100%酒精(Ⅰ、Ⅱ )1-2h。

 

8)二甲苯(Ⅰ)5-30min。

 

9)(二甲苯(Ⅱ) 5-30min)。

 

10)浸蠟(Ⅰ、Ⅱ )2h。

 

11)組織包埋 

 

9、石蠟切片與冰凍切片的優(yōu)缺點? 

 

石蠟切片優(yōu)點1.標(biāo)本大小靈活2.切片厚度均勻(1-200μm)3.可少量或批量制作4.切片保持時間長 缺點1.不能很好地保存細(xì)胞組織內(nèi)酶或抗原的活性2.脂肪被溶解3.不能保障大且堅硬組織的切片質(zhì)量 

 

冰凍切片法優(yōu)點• 切片制作時間短• 較好的保存脂肪和類脂、酶及抗原活性• 可應(yīng)用于脂肪顯示,酶的定位、定性甚至定量、組織熒光、免疫熒光和放射自顯影等方面 

 

缺點• 標(biāo)本結(jié)構(gòu)和形態(tài)的顯示遜色于石蠟切片• 冷凍過程中易形成“冰晶”• 難以制作連續(xù)切片和薄的切片 

 

10、染色的目的,普通染色、特殊染色、復(fù)染色定義。常用染色方法。

 

染色的目的:將標(biāo)本切片浸于染色劑內(nèi),經(jīng)一定的時間,使組織或細(xì)胞及其他的成分被染上不同的顏色,產(chǎn)生不同的折射率,便于在光鏡下進(jìn)行觀察。 

 

普通染色:最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色,又稱常規(guī)染色。 特殊染色:為顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分。 復(fù)染色:襯托主染色所進(jìn)行的染色。

 

常用的染色方法 

 

一)蘇木精(素):是現(xiàn)今最常用、最有價值的常規(guī)細(xì)胞核染色劑,習(xí)慣上稱蘇木精是堿性染料 

 

二)伊紅:是一種胞漿較理想的染色劑。常用伊紅Y。酸性染料組織成分呈彌漫性染色。 

 

11、石蠟切片常規(guī)染色步驟。 

 

1) 脫蠟至水 

①二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5-10min②100%乙醇 (5~10)min×2或3次③依次95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5~10min④蒸餾水浸洗 2~5min 

 

2)蘇木精染色: 

① 蘇木精1-10min。② 自來水流水沖洗。③ 0.5%鹽酸-乙醇分色,數(shù)秒-數(shù)十秒。自來水快洗。④ 0.5%氨水藍(lán)化,30sec-1min,自來水沖洗⑤ 光鏡下鏡檢細(xì)胞核分色程度。⑥ 自來水流水沖洗3min。 

 

3)伊紅染色 

① 1%伊紅1-10min。 ② 蒸餾水快洗。 

 

4)脫水、透明和封固: 

① 70%、80%、90%乙醇速洗,每級數(shù)秒-數(shù)十秒。② 95%30sec-1min.光鏡下監(jiān)控細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)顏色對比。 ③ 100%乙醇,3-5min,2次。④ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ,各5-10min。⑤ 封片:中性樹膠

 

12、組織化學(xué)定義及特征。 

 

組織化學(xué)(histochemistry)或細(xì)胞化學(xué)(cytochemistry):是基于已知的化學(xué)反應(yīng),在組織或細(xì)胞原位上顯示出組織或細(xì)胞中的化學(xué)物質(zhì),并研究其化學(xué)性質(zhì)及功能關(guān)系的一門技術(shù)。是在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上,研究組織或細(xì)胞中化學(xué)物質(zhì)的形態(tài)、化學(xué)成分及定位、定量和代謝狀態(tài)的學(xué)科。 

 

組織化學(xué)的特征:應(yīng)用物理的和化學(xué)的方法來查明細(xì)胞或組織的化學(xué)成分; 用組織學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)原理,研究細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)、功能與化學(xué)的關(guān)系; 

 

對細(xì)胞或組織成分的定位、定性、定量的特征進(jìn)行研究,來認(rèn)識細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 具有較強(qiáng)的特異性。 

 

13、組織化學(xué)技術(shù)的基本要求。 

 

為了能在完好的結(jié)構(gòu)上同時顯示其化學(xué)物質(zhì),組織化學(xué)技術(shù)必須做到:

 

(1)保存組織(細(xì)胞)在生活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu); 

 

(2)保存組織(細(xì)胞)內(nèi)的生前化學(xué)成分、酶活性及檢測目的物; 

 

(3)所使用的染色方法是按照已知的化學(xué)或物理反應(yīng)原理進(jìn)行。 

 

(4)反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)在組織結(jié)構(gòu)上形成穩(wěn)定的有色沉淀物質(zhì)。 

 

(5)檢測手段要有高度的敏感性、特異性和可重復(fù)性。 

 

(6)生成物的反應(yīng)產(chǎn)物必須在原位沉淀,保證定位的精確性及穩(wěn)定性。 

 

14、組織(細(xì)胞)化學(xué)基本步驟冰凍切片或石蠟切片等常規(guī)處理后,再進(jìn)行組織(細(xì)胞)化學(xué)染色,在光鏡下觀察。 

 

15、組織(細(xì)胞)化學(xué)染色方法分類。 

 

純化學(xué)方法:Schiff反應(yīng)法、偶氮偶聯(lián)法、金屬沉淀法、聯(lián)苯胺反應(yīng)、四唑鹽反應(yīng) 

 

類化學(xué)方法:屬某些特殊染色技術(shù),如:Best洋紅染色 顯示糖原,Baker酸性蘇木精染色 顯示磷脂,Mayer黏洋紅與黏蘇木素 顯示黏蛋白 

 

物理學(xué)方法:1)脂溶染色法2)熒光分析3)放射自顯影 物理化學(xué)方法等 

 

16、糖類、蛋白質(zhì)、核酸及脂類物質(zhì)的常用顯示方法。 糖類物質(zhì)的顯示方法: 

 

PAS顯示法(Periodic Acid Schiff)、阿利新藍(lán)法(Alcian Blue)、阿利新藍(lán)-PAS復(fù)合法(Alcian Blue-PAS)、胭脂卡紅法(Carmine method)、甲苯胺藍(lán)法 硫堇法等。 

 

蛋白質(zhì)顯示方法:

 

1、pH4.2以下的酸性溶液中,用堅牢綠、溴酚藍(lán)、麗春紅-2R等酸性染料染色,出現(xiàn)陽性結(jié)果表明有蛋白質(zhì)存在

 

2、在pH8.0以上的堿性溶液中,用酸性染料染色,呈陽性結(jié)果表明含堿性蛋白質(zhì)

 

3、若第2步為陰性結(jié)果,則改在酸性溶液中用堿性染料(亞甲基藍(lán))染色。 

 

核酸顯示:1、顯示DNA : Feulgen法試劑:Schiff試劑、鹽酸、亞硫酸氫鈉 2、核仁組成區(qū)和酸性粘多糖復(fù)合顯示法:試劑:2%的甲酸、2%的明膠、50%的硝酸銀、阿申藍(lán)(8GX)、醋酸溶液3、粘多糖和核仁組成區(qū)雙染法試劑:Schiff氏試劑、膠性銀液 4、RNA和DNA的甲綠-派若寧顯示法試劑:甲綠、派若寧。 

 

17、酶組織(細(xì)胞)化學(xué)、常用方法及影響酶活性的因素。 

 

酶組織(細(xì)胞)化學(xué):用組織(細(xì)胞)化學(xué)方法顯示酶在組織或細(xì)胞內(nèi)的定位的技術(shù)。 

 

常用的方法:酸性磷酸酶  堿性磷酸酶  三磷酸腺苷酶  乙酰膽堿酯酶  細(xì)胞色素氧化酶 一氧化氮合酶 

 

影響酶活性的因素:

 

1 、溫度:大部分酶反應(yīng)的合適溫度為37℃。

 

2、 pH: 酶有適合酶反應(yīng)速度的pH(大部分為7.0   

 

3、抑制劑 能使酶活性降低的物質(zhì)

 

4、激活劑 能使酶活性增高的化學(xué)物質(zhì)

 

5 、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響

 
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