Stefan Hell打破了物理學(xué)界的傳統(tǒng)看法
自從1873年Ernst Abbe第一次發(fā)現(xiàn)光學(xué)成像具有衍射限制現(xiàn)象以來(lái)，物理學(xué)界就公認(rèn)，顯微鏡的分辨率具有極限，該極限與光源的波長(zhǎng)有關(guān)。直到一個(gè)多世紀(jì)之后，羅馬尼亞物理學(xué)家Stefan Hell推翻了這一觀點(diǎn)。他是首位不僅從理論上論證了，而且用實(shí)驗(yàn)證明了使用光學(xué)顯微鏡能達(dá)到納米級(jí)分辨率的科學(xué)家。
羅馬尼亞物理學(xué)家Stefan Hell，現(xiàn)任德國(guó)馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究院(Max Planck Institute of Biophysical Chemistry)主任。
早在上世紀(jì)80年代中期，當(dāng)時(shí)師從德國(guó)海德堡大學(xué)(University of Heidelberg)一位低溫固態(tài)物理學(xué)家的Stefan Hell就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果不是像常規(guī)那樣使用一個(gè)透鏡聚焦，而是將兩個(gè)大孔徑的透鏡組合在一起聚焦，就可以提高光學(xué)顯微鏡的分辨率。Stefan Hell是首位發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象的研究人員。
Hell于1990年順利完成了他的博士學(xué)業(yè)，但同時(shí)，這也意味著他將無(wú)法再憑借獎(jiǎng)學(xué)金的資助進(jìn)行研究了。Hell最終決定獨(dú)自一人繼續(xù)在家研究以上的發(fā)現(xiàn)，并最終成功發(fā)明了4Pi顯微鏡。
4Pi顯微鏡，超高分辨率成像中的一個(gè)步驟
時(shí)任美國(guó)馬薩諸塞州坎布里奇市哈佛大學(xué)(Harvard University)化學(xué)系教授的Sunney Xie遇到了Hell，當(dāng)他了解了Hell發(fā)明的4Pi高分辨率顯微鏡時(shí)，Xie對(duì)Hell勇敢地對(duì)傳統(tǒng)物理學(xué)觀點(diǎn)提出挑戰(zhàn)的精神表示贊許。
隨后，Hell帶著他的發(fā)明來(lái)到了位于德國(guó)海德堡的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)，并獲得了德國(guó)科學(xué)基金會(huì)提供的獎(jiǎng)學(xué)金。1991年，Hell在該實(shí)驗(yàn)室開始他的博士后研究工作。
起初，許多科學(xué)家，包括那些聲名顯赫的物理學(xué)家都認(rèn)為Hell的工作對(duì)于提高光學(xué)顯微鏡的分辨率沒(méi)有太大的意義。他們認(rèn)為，Hell僅用他那少得可憐的科研經(jīng)費(fèi)來(lái)從事這項(xiàng)研究簡(jiǎn)直就是在冒險(xiǎn)。但Hell卻始終堅(jiān)信他能夠打破衍射極限。
Hell的努力沒(méi)有白費(fèi)，他的冒險(xiǎn)終于獲得了回報(bào)。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率顯微鏡證明了他的確能將傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率提高3~7倍。然而，盡管Hell提高了Z方向的分辨率，他還是沒(méi)能突破衍射極限的限制。
此后不久，Hell又在芬蘭土爾庫(kù)大學(xué)(University of Turku)得到了他的第二個(gè)博士后職位。一個(gè)星期六的早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有關(guān)光學(xué)量子理論的書，突然，靈光一閃，Hell腦海里浮現(xiàn)了一個(gè)想法：如果使用一種合適的激光，僅激發(fā)一個(gè)點(diǎn)的熒光基團(tuán)使其發(fā)光，然后再用一個(gè)面包圈樣的光源抑制那個(gè)點(diǎn)周圍的熒光強(qiáng)度，這樣就只有一個(gè)點(diǎn)發(fā)光并被觀察到了。Hell給他的這項(xiàng)發(fā)明取名STED，即受激發(fā)射損耗顯微鏡(stimulated emission depletion)。有了這個(gè)想法后，Hell立即行動(dòng)，沖進(jìn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。每當(dāng)回想起當(dāng)時(shí)的心情，Hell都會(huì)覺得那是他科研生涯中最激動(dòng)的時(shí)刻。
曾在EMBL與Hell共事，并共同研發(fā)4Pi顯微鏡的Pekka Hanninen指出，Hell在土爾庫(kù)大學(xué)進(jìn)行研究工作時(shí)非?？炭?。那時(shí)，他經(jīng)常被許多問(wèn)題困擾。盡管如此，研究過(guò)程中還是有許多快樂(lè)縈繞著他們。Hell不僅是一名嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)研究者，還是一名音樂(lè)愛好者，每當(dāng)工作至深夜時(shí)，實(shí)驗(yàn)室走廊總會(huì)回響起Hell吹奏薩克斯風(fēng)的動(dòng)聽樂(lè)聲。
由共聚焦顯微鏡(左圖)和STED(右圖)成像的一個(gè)神經(jīng)元。
1994年，Hell在《光學(xué)快報(bào)》(Optics Letters)上發(fā)表了他關(guān)于STED的理論文章。不過(guò)直到多年以后，這項(xiàng)理論才得以在實(shí)踐中被證實(shí)。在那段時(shí)間里，Hell一面繼續(xù)研究工作，一面四處奔走籌集科研經(jīng)費(fèi)，還賣掉了他4Pi 顯微鏡的專利。
但是那個(gè)時(shí)候Abbe的衍射極限理論仍然在學(xué)界占統(tǒng)治地位，許多物理學(xué)家對(duì)Hell的理論都持懷疑甚至批評(píng)態(tài)度，因此他們也都將研究重點(diǎn)放在其它的成像技術(shù)上。盡管如此，Hell還是在1997年與馬普生物物理化學(xué)研究所簽訂了一份長(zhǎng)達(dá)5年的合同，以繼續(xù)他的STED研究。
1999年，Hell將他的研究成果分別投給了《自然》(Nature)雜志和《科學(xué)》(Science)雜志，不過(guò)都被退稿。當(dāng)時(shí)兩位雜志的主編都沒(méi)有意識(shí)到他的研究成果將會(huì)改變整個(gè)顯微鏡領(lǐng)域。
直到2000年，事情才終于有了轉(zhuǎn)機(jī)——《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(PNAS)發(fā)表了Hell的科研成果。采用 Hell的STED技術(shù)，人們第一次得到了納米級(jí)的熒光圖像。Hell的工作由此獲得了廣泛的肯定，2002年，他獲得了馬普研究所的終身職位。從此，Hell一直在馬普研究所從事成像技術(shù)的研究工作。
緊隨STED這項(xiàng)開創(chuàng)性工作之后，世界各地實(shí)驗(yàn)室等研究機(jī)構(gòu)內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)了一批高分辨率的顯微鏡技術(shù)。例如，由珍妮莉婭法姆研究學(xué)院(Janelia Farm Research Campus)的物理學(xué)家兼工程師Mats Gustafsson領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡(structured-illumination microscopy, SIM)。
果蠅卵母細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白的3D SIM成像，該照片拍攝于完整的卵泡內(nèi)。
SIM技術(shù)的原理是通過(guò)一系列光成像的圖案對(duì)低分辨率莫爾條紋形式的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，此類圖像是采用其它技術(shù)所無(wú)法觀察到的。然后再由計(jì)算機(jī)處理、分析這些條紋中包含的信息，最終就可以獲得高分辨率的圖像。
同年，Gustafsson小組得到了HeLa細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的圖像，他的圖像相比傳統(tǒng)顯微鏡的圖像來(lái)說(shuō)，在測(cè)向上的分辨率提高了2倍。隨后，Gustafsson小組又使用非線性技術(shù)將整體分辨率提高了4倍。
科研競(jìng)賽
2006年，超高分辨率顯微鏡研究行業(yè)翻開了新的篇章。Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小組、Samuel Hess小組以及莊曉威(音譯)科研小組幾乎同時(shí)報(bào)道了他們提高顯微鏡分辨率的科研成果，下面分別介紹這三個(gè)小組的研究情況。
Eric Betzig、Harald Hess以及Jennifer Lippincott-Schwartz小組
2005年夏天，細(xì)胞生物學(xué)家Jennifer Lippincott-Schwartz卸下了她在美國(guó)馬里蘭州貝塞斯達(dá)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(HIV)暗室里的紅色燈泡。Lippincott-Schwartz正在為賦閑在家的兩位物理學(xué)家Eric Betzig和Harald Hess騰出空間，籌備實(shí)驗(yàn)室。正是這兩位物理學(xué)家研制出了光敏定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy, PALM)，他們的這種新產(chǎn)品能將熒光顯微鏡的分辨率提升至納米級(jí)水平。
接下來(lái)的整個(gè)冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那間狹小的沒(méi)有取暖設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室里工作。現(xiàn)在就職于美國(guó)弗吉尼亞州阿士伯恩霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所珍妮莉婭法姆研究學(xué)院(Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Farm Research Campus in Ashburn, Virginia)的Hess承認(rèn)，自己與Betzig對(duì)生物學(xué)的認(rèn)識(shí)都不深。不過(guò)近15年來(lái)，他們一直都在努力，希望能運(yùn)用生物學(xué)知識(shí)獲取高分辨率的顯微圖像，但是沒(méi)有取得明顯進(jìn)展。然而，當(dāng)Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年發(fā)明的光敏綠色熒光蛋白(photoactivatable green fluorescent protein)后，他們知道他們已經(jīng)找到了解決問(wèn)題的關(guān)鍵所在。
回想起當(dāng)時(shí)的情形，Lippincott-Schwartz指出：“他們當(dāng)時(shí)非常激動(dòng)。我還記得當(dāng)我們得到第一張顯微圖像時(shí)，你根本無(wú)法看出那是什么東西。直到我看到他們將熒光圖像和電鏡圖像疊加之后的結(jié)果才相信，我們成功了。我當(dāng)時(shí)覺得這一切真是太神奇了?！?/P>
2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小組在《科學(xué)》(science)雜志上發(fā)表了他們的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到細(xì)胞黏著斑和特定細(xì)胞器內(nèi)的蛋白質(zhì)。
Samuel Hess小組
Samuel Hess小組是上述三個(gè)小組之一。Hess是美國(guó)緬因州立大學(xué)(University of Maine)物理系的助理教授。2005年夏天，Hess一直在和他們學(xué)校的化學(xué)工程師和生物學(xué)工程師，就如何提高觀察活體細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)的分辨率等問(wèn)題進(jìn)行交流。
2005年的一個(gè)夏夜，Hess被鄰居家舉辦舞會(huì)的聲音吵醒。半睡半醒的Hess走下樓來(lái)，隨手畫了一副設(shè)計(jì)圖，他的這種設(shè)計(jì)是需要借助熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)來(lái)顯示細(xì)胞形態(tài)的。第二天早上，當(dāng)Hess重新翻看這幅非清醒狀態(tài)繪制的潦草的設(shè)計(jì)圖時(shí)，不由得大笑起來(lái)。不過(guò)令人吃驚的是，他的這幅設(shè)計(jì)圖竟然沒(méi)有一點(diǎn)問(wèn)題。于是他把這幅圖拿給物理系的同事檢查，但同事也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何問(wèn)題。
接下來(lái)，Hess就按照他的設(shè)計(jì)圖開始制作顯微鏡了。此時(shí)，他的科研經(jīng)費(fèi)所剩不多，而結(jié)題時(shí)間轉(zhuǎn)眼就到。因此，Hess等人以最快的速度組裝好顯微鏡，并進(jìn)行了試驗(yàn)。同時(shí)，在不到兩天的時(shí)間里，緬因州立大學(xué)表面科學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的同事就為Hess制備好供檢驗(yàn)顯微鏡效果的藍(lán)寶石晶體樣品。
對(duì)于同事們的幫助，Hess總是不勝感激。
2006年，《生物物理學(xué)期刊》(Biophysical Journal)刊登了Hess小組的科研成果。他們將這項(xiàng)研究成果命名為熒光光敏定位顯微鏡(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。2007年，Hess小組證明了FPALM可以分辨細(xì)胞膜脂筏上的蛋白質(zhì)簇。
莊曉威科研小組
與此同時(shí)，另一個(gè)研究小組——哈佛大學(xué)霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所(Howard Hughes Medical Investigator at Harvard University)的研究員莊曉威科研小組也在研究高分辨率成像技術(shù)。
通過(guò)3D STORM觀察到的一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)線粒體網(wǎng)狀系統(tǒng)。傳統(tǒng)熒光成像(左圖);3D STORM成像(中圖)，其中，采用不同顏色標(biāo)記出z的位置;3D STORM成像中xy維圖像(右圖)。
其實(shí)，這三個(gè)小組都有一個(gè)共同的也是非常簡(jiǎn)單的理念，那就是先獲得單分子熒光圖像，再將成千上萬(wàn)個(gè)單分子圖像疊加在一起，獲得最終的高分辨率的圖像。
早在2004年初，莊等人就已經(jīng)意外發(fā)現(xiàn)了有一些花青染料可以用作光敏開關(guān)。這也就意味著這些染料既可以被激活發(fā)出熒光，也可以被關(guān)閉不發(fā)光，人們可以使用不同顏色的光束來(lái)隨意控制這些花青染料的開和關(guān)。
從那以后，莊等人就一直在研究如何用光敏開關(guān)探針來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子發(fā)光技術(shù)。他們希望能用光敏開關(guān)將原本重疊在一起的幾個(gè)分子圖像暫時(shí)分開，這樣就能獲得單分子圖像，從而提高分辨率。Eric Betzig小組和Samuel Hess小組也都采用了同樣的策略，只不過(guò)他們使用的不是光敏開關(guān)而是一種可以先被熒光激活繼而被漂白失活的探針。
2006年，莊的科研成果在《自然-方法》(Nature Methods)雜志上發(fā)表，他們將這項(xiàng)成果命名為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體分子。
此后幾年，超高分辨率熒光顯微鏡又得到了進(jìn)一步的發(fā)展。現(xiàn)在，生物學(xué)家已經(jīng)能夠使用超高分辨率熒光顯微鏡在納米水平上觀察細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的生化變化了。以往那些大小在200nm至750nm之間的模糊泡狀圖像再也無(wú)法對(duì)他們?cè)斐衫_了。盡管早在上世紀(jì)80年代，科研機(jī)構(gòu)里就已經(jīng)出現(xiàn)了超高分辨率顯微鏡的構(gòu)思，但只是最近幾年里這項(xiàng)技術(shù)才伴隨著它的商業(yè)化進(jìn)程獲得了快速發(fā)展?，F(xiàn)在，已經(jīng)有幾十家實(shí)驗(yàn)室安裝了這種最新型的顯微鏡并投入了使用。正像Lippincott-Schwartz所說(shuō)的，超高分辨率顯微鏡正在以飛快的速度被科研界接受，在生物學(xué)界更是如此。
超高分辨率顯微鏡的成績(jī)
已經(jīng)開始使用這些顯微鏡的生物學(xué)家對(duì)這項(xiàng)技術(shù)都表示出了極高的熱情。Jan Liphardt這位在美國(guó)勞倫斯伯克力國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(Lawrence Berkeley National Laboratory)工作的生物學(xué)家，還清楚地記得他2006年第一次在《科學(xué)》(science)雜志讀到Betzig的那篇有關(guān)PALM技術(shù)的論文時(shí)的激動(dòng)心情。當(dāng)他看到那幅線粒體蛋白的圖像時(shí)立刻想到了該技術(shù)可以用于他自己的微生物研究領(lǐng)域。
Liphard說(shuō)道：“通常，我們得到的大腸桿菌熒光圖像都只有20像素，甚至更低，現(xiàn)在突然有一幅幾千像素的圖片擺在你面前，你可以想象那是一種什么感覺。”
Liphard現(xiàn)在正與Betzig以及其他一些研究人員一起研究大腸桿菌的趨化現(xiàn)象(chemotaxis)。Liphard還提到：“我從沒(méi)想到這項(xiàng)技術(shù)達(dá)到的分辨率有這么高，可以如此清楚地看到細(xì)胞內(nèi)單個(gè)蛋白質(zhì)分子的定位，甚至還能定量。而對(duì)我來(lái)說(shuō)，每天的工作實(shí)際上就是在弄清楚這些蛋白質(zhì)在什么位置，什么時(shí)候存在。而之前我們的研究主要采用間接方法。但超高分辨率顯微鏡這項(xiàng)新技術(shù)是我從事科研工作這么長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，感觸最深，獲益最大的一項(xiàng)科技成果?！?/P>
美國(guó)丹佛市科羅拉多州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院(Medicine at the University of Colorado Denver)的助理教授Nicholas Barry也正在和Betzig合作，他們使用了一臺(tái)蔡司的全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)(total internal reflection fluorescence imaging, TIRF)來(lái)研究腎細(xì)胞頂端胞膜上的蛋白質(zhì)簇。
Barry指出，只需要一臺(tái)蔡司顯微鏡和普通電腦，差不多就足夠了。此外，他們還花費(fèi)3萬(wàn)美元添置了兩臺(tái)激光發(fā)射器?，F(xiàn)在，Barry等人可以在8分鐘內(nèi)得到一幅圖像，這幅圖像由10000幀圖像合成，每一幀圖像上顯示10個(gè)分子。最后的圖像文件大小大約是0.3GB。Barry等人還使用Perl語(yǔ)言自己開發(fā)了一套免費(fèi)程序。Barry表示：“這里面包含了每幀圖像的資料信息，客戶可以根據(jù)這些信息進(jìn)行相關(guān)計(jì)算?！盉arry充滿信心地提到，很快就會(huì)有人為NIH的那套免費(fèi)圖像分析軟件ImageJ開發(fā)出一套運(yùn)算程序作為插件使用。
美國(guó)斯坦福大學(xué)(Stanford University)化學(xué)及應(yīng)用物理系教授W.E. Moerner曾于1989年第一個(gè)在試驗(yàn)中使用光學(xué)顯微鏡得到了單分子圖像。W.E. Moerner教授表示，這幾年來(lái)，超高分辨率顯微鏡研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，終于達(dá)到了納米級(jí)單分子分辨率。他興奮地說(shuō)：“經(jīng)過(guò)了近20年對(duì)單分子成像課題的研究，我們終于取得了完美的成果?！?/P>
展望
自從2006年STORM技術(shù)和PALM技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，科技工作者就一直在不斷努力，對(duì)它們進(jìn)行改進(jìn)、完善和提升。2008年，Lippincott-Schwartz的研究團(tuán)隊(duì)將PALM技術(shù)和單顆粒示蹤技術(shù)(single-particle tracking)結(jié)合，成功地觀測(cè)到活體細(xì)胞胞膜蛋白的運(yùn)動(dòng)情況。同年，莊小威研究組在《科學(xué)》(science)雜志上也發(fā)表了他們的3D STORM成像成果，該技術(shù)的空間分辨率比以往所有光學(xué)3D成像技術(shù)的分辨率都要高出10倍。論文中，他們展示了用3D STORM成像技術(shù)拍攝的腎細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖和其它的分子結(jié)構(gòu)圖。隨后，他們又進(jìn)一步將該技術(shù)發(fā)展成了多色3D成像技術(shù)(multicolor 3D imaging)。Gustafsson，還有其他一些科研工作者使用3D SIM技術(shù)(該技術(shù)使用3束干涉光，而不是常見的2束)觀察到了共聚焦顯微鏡(confocal microscopes)無(wú)法觀測(cè)到的哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)。位于德國(guó)的世界知名光學(xué)儀器制造公司蔡司公司進(jìn)一步發(fā)展了SIM和PALM技術(shù)，不過(guò)他們將PALM稱為PAL-M。蔡司公司預(yù)計(jì)將于2009年末推出全新的成像產(chǎn)品。
2008年，Hell小組使用STED技術(shù)通過(guò)抗體標(biāo)記目標(biāo)蛋白，觀察到了活體神經(jīng)元細(xì)胞中突觸小泡(synaptic vesicles)的運(yùn)動(dòng)過(guò)程。同年稍晚些時(shí)候，他們又使用4Pi顯微鏡和STED技術(shù)得到了固定細(xì)胞內(nèi)線粒體的3D圖像，分辨率達(dá)到了40至50nm。最近，他們又使用超高分辨率顯微鏡成像技術(shù)對(duì)腦切片組織中的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了研究，并得到了活體神經(jīng)元細(xì)胞樹突棘(dendritic spines)的3D圖像。
PALM在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)拍攝到的粘附復(fù)合物。
由于最近幾年這些新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，現(xiàn)在可以對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行三維觀察了。Gustafsson指出，隨著PALM技術(shù)和STORM等新技術(shù)的出現(xiàn)，以前很多看起來(lái)不可能的事情現(xiàn)在都變得可能了。
盡管已有許多科學(xué)家從這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)展中獲益，但是仍然可以進(jìn)一步提高，以使更多的研究人員能夠在自己的工作中使用它。到目前為止，那些成功應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室都采取了正確的技術(shù)組合：研究人員可以很好地將物理學(xué)與生物學(xué)相結(jié)合——他們將顯微鏡裝配并做適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，然后用它對(duì)生物學(xué)樣品進(jìn)行檢測(cè)。Moerner指出，軟件的編寫也不容小覷：對(duì)檢測(cè)到的光子進(jìn)行定位和報(bào)告需要進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算，從而得到合適的分辨率。
僅僅是顯微鏡的價(jià)格就已經(jīng)限制了它的普及性，Leica’s TCS STED顯微鏡高達(dá)100萬(wàn)美元。因此，如何獲得相應(yīng)的資金來(lái)購(gòu)置顯微鏡仍然是擺在研究人員面前的一個(gè)難題，位于丹佛市的科羅拉多大學(xué)(University of Colorado)光學(xué)顯微鏡組主任Bill Betz這樣說(shuō)道。
Betz曾申請(qǐng)用于顯微鏡購(gòu)置的資金，但遭到了拒絕。但他表示，他們已經(jīng)計(jì)劃再次申請(qǐng)相關(guān)資金。而Stefan Hell曾指出，激光領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)展已經(jīng)可以使得研究人員自己在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)構(gòu)建一個(gè)STED平臺(tái)，花費(fèi)只需不到10萬(wàn)美元。
除了要將這一技術(shù)方法普及，使生物學(xué)家能夠加以利用之外，該項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)人員還表示，他們已經(jīng)開始致力于研究更寬范圍及更多樣的熒光探針了。更好的探針當(dāng)然能夠?yàn)槲覀儙?lái)更高的分辨率及更快速的圖像處理。美國(guó)紐約阿爾伯特•愛因斯坦醫(yī)學(xué)院(Albert Einstein College of Medicine)解剖學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)副教授Vladislav Verkhusha說(shuō)到：“為了對(duì)活體哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行研究，你就需要有一整套的熒光標(biāo)記蛋白和可通過(guò)光控開關(guān)控制的蛋白質(zhì)。”他本人在熒光蛋白領(lǐng)域的研究工作就受益于PALM的出現(xiàn)。
莊曉威的眾多項(xiàng)目之一便是與Alice Ting及其在麻省理工學(xué)院(MIT)的實(shí)驗(yàn)室合作，對(duì)蛋白標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行研究，希望能夠找到一種方法可以將小和明亮的光控開關(guān)可控的探針標(biāo)記于細(xì)胞的特異蛋白上，從而可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像。她提到：“將遺傳標(biāo)記方法與小而明亮且可被光控開關(guān)控制的探針結(jié)合在一起，將是今后發(fā)展分子級(jí)別超高分辨率成像的十分理想的一種方法。”
盡管研發(fā)人員還將繼續(xù)努力，以進(jìn)行相應(yīng)技術(shù)的提高，但是超高分辨率熒光顯微鏡更加廣泛的應(yīng)用還是毫無(wú)疑問(wèn)地成為新的一年的標(biāo)志。Harald Hess說(shuō)：“這一技術(shù)的確會(huì)為生物學(xué)家的工作帶來(lái)很大的幫助。同時(shí)，我們也在不斷詢問(wèn)，‘你們想要用它做什么精彩的實(shí)驗(yàn)?’事實(shí)上，我們也得到了許多精彩的答案?！?/P>
