顯微鏡(microscope)作為一種借助物理方法產(chǎn)生物體放大影像的儀器用于科學研究,至今已經(jīng)有數(shù)百年歷史,而且已經(jīng)成為一種極為重要的科學儀器, 廣泛地用于生物學、化學、物理學、冶金學、釀造等各種科研活動,對人類的發(fā)展做出了巨大而卓越的貢獻。
據(jù)美國化學會《化學與工程新聞》(C&NS)周刊網(wǎng)站2014年3月28日報道,科學家已經(jīng)研究出新型電子顯微鏡,該顯微鏡能夠觀察到接近原子水平的線粒體核糖體(mitochondrial ribosome)的結構(見下圖),這種顯微鏡發(fā)展史上具有里程碑意義的研究成果,對于結構生物學研究而言,無疑在技術支撐方面帶來了革命性的新變化。下圖是酵母線粒體核糖體的結構圖示,與細菌核糖體(藍色)和哺乳動物線粒體核糖體(紅色)有類似的一些特性,但是有些特征只有在酵母中存在(黃色)。
Fig. 1 The structure of the yeast mitochrondrial ribosome (shown) shares some features with the bacterial ribosome (blue) and with mammalian mitochondrial ribosomes (red). Some features are present only in yeast (yellow).Credit: Alan Brown
顯微鏡發(fā)展歷史
盡管關于顯微鏡的發(fā)展歷史,甚至可以追溯到16世紀晚期,當時復式顯微鏡就已經(jīng)問世。如1595年,荷蘭的著名磨鏡師詹森(Zacharias Janssen, born 1585 - died pre-1632)發(fā)明了第一個簡陋的復式顯微鏡。這種顯微鏡是由3個鏡筒連接而成。當該顯微鏡的2個活動鏡筒完全收攏時,它的放大倍數(shù)是3倍;當2個活動鏡筒完全伸出時,它的放大倍數(shù)是10倍,其實這也是最早的變焦鏡頭。
復式顯微鏡在性能上明顯優(yōu)于單式顯微鏡(即只有一個透鏡的顯微鏡),首先是它可以把幾個放大倍數(shù)較小的凸透鏡組合起來獲得很高的放大率;其次是制造工藝較簡單,不必磨制一個個極小的透鏡。復式顯微鏡的發(fā)明,是科學史上的里程碑,人類從此開始認識微觀世界變得更加容易。不過,由于技術條件不成熟,16世紀的顯微鏡放大倍數(shù)都不高,因此在16世紀,人類在探索微觀世界方面并沒有什么激動人心的發(fā)現(xiàn)。但是到了17世紀,單式顯微鏡的發(fā)展與其說是科學儀器,不如說是藝術品。盡管如此,列文?虎克(Avon Leeuwenhoek, 1632-1723)的單式顯微鏡還是值得一提,它被認為是單式顯微鏡發(fā)展的頂峰。
列文?虎克是一位荷蘭科學家,他在1677年用自制的高倍放大鏡觀察池塘水中的原生動物、蛙腸內(nèi)的原生動物、人類和哺乳類動物的精子;后又在鮭魚的血液中看到紅細胞的核。1683年,他又在牙垢中看到了細菌。他把觀察的現(xiàn)象報告給英國皇家學會,得到英國皇家學會的肯定。
列文?虎克出身于布商,他最初磨制透鏡的目的是為了檢驗布的質(zhì)量,但他在掌握了高水平的磨制透鏡技術后,進而利用透鏡組裝成顯微鏡,并利用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了前人未曾見到過的一些活細胞,這些成就是十分難能可貴的。他一生親自磨制了550個透鏡,裝配了247架顯微鏡,為人類創(chuàng)造了一批寶貴的財富,至今保留下來的有9架,現(xiàn)存于荷蘭尤特萊克特大學博物館(University Museum of Utrecht)中的一架放大倍數(shù)為270倍,分辨力為1.4 μm。在當時,這個水平是很高的,直到19世紀初所制的顯微鏡還未超過這一水平。因此,我們不能忽視他對細胞生物學的發(fā)展所做貢獻的重要性,賦予他原生動物之父本身就是對其貢獻的一種肯定。
雖然說列文?虎克一生制造了數(shù)百個顯微鏡,它們的共同特點都是非常小,而且設計和功能也相似,這不能不說也是其一大缺陷。盡管如此,他的顯微鏡對于細胞生物學的研究,真正觀察活細胞仍然具有里程碑意義。
17世紀制造和使用復式顯微鏡的除了列文?虎克之外,還有意大利物理學家、數(shù)學家、天文學家及哲學家伽利略((Galileo Galilei, 1564-1642)和英國博物學家、發(fā)明家羅伯特?胡克(Robert Hooke,1635-1703),他設計制造了真空泵、顯微鏡和望遠鏡,并將自己用顯微鏡觀察所得寫成《顯微術》一書;cell(細胞)一詞就是由他命名的,中文翻譯后稱為細胞。
19世紀和20世紀初期,顯微鏡的研究已經(jīng)取得了長足發(fā)展,先后出現(xiàn)了帶自動照相機的光學顯微鏡、裝有場發(fā)射槍的掃描電子顯微鏡、超高壓透射電子顯微鏡等。電子顯微鏡技術的開拓者之一恩斯特?奧古斯特?弗里德里希?魯斯卡(Ernst August Friedrich Ruska,1906-1988)特別值得一提。
恩斯特?魯斯卡生于海德堡,是德國東方學家、科學歷史學家和教育家尤利烏斯?魯斯卡(Julius Ruska)的兒子,恩斯特?魯斯卡的弟弟赫爾穆特?魯斯卡(Helmut Ruska)是一名醫(yī)生,也是電子顯微鏡的先驅(qū)之一。恩斯特?魯斯卡在海德堡讀完中學后,1925年起在慕尼黑工業(yè)大學學習電子學,1927年轉到柏林工業(yè)大學,1931年4月7日,他和馬克斯?克諾爾(Max Knoll)成功用磁性鏡頭制成第一臺二級電子光學放大鏡,實現(xiàn)了電子顯微鏡的技術原理,基于磁場會因電子帶電而偏移的現(xiàn)象,使得通過鏡頭的電子射線能夠像光線一樣被聚焦,當時被稱為“超顯微鏡”。因為電子的波長遠小于光線的波長,因此電子顯微鏡的分辨率明顯優(yōu)于光學顯微鏡。
1933年恩斯特?魯斯卡完成論文《關于電子顯微鏡的磁性鏡頭》(über ein magnetisches Objektiv für das Elektronenmikroskop)并獲得博士頭銜。由于電子顯微鏡的商業(yè)化開發(fā)不是大學研究所的任務,研究所的儀器也無法達到這個要求,恩斯特?魯斯卡開始在電子光學的工業(yè)界尋求新的發(fā)展。
他于1933~1937年在柏林電視機股份公司(Berliner Fernseh AG)的研發(fā)部門工作,負責電視機接收發(fā)送管和帶二級放大器的光電池的開發(fā)。在此期間,他同博多?馮?博里斯(Bodo von Borries)開始試探性地開發(fā)高分辨率的電子顯微鏡。1936年底1937年初,他們在西門子公司的電子顯微鏡工業(yè)研發(fā)工作實現(xiàn)了這一目標,在柏林設立了電子顯微鏡實驗室,并于1939年研發(fā)出了第一臺能夠批量生產(chǎn)的“西門子-超顯微鏡”。
恩斯特?魯斯卡因為對電子顯微鏡研究的突出貢獻,1986年獲得諾貝爾物理學獎。他們設計制造的電子顯微鏡,其性能遠遠超過了光學顯微鏡。后來經(jīng)過人們的努力,電子顯微鏡的分辨率由最初的500 nm提高到現(xiàn)在的0.1 nm;放大率已達到幾十萬倍以上。例如穿透式電子顯微鏡可放大80萬倍,可以看出分子的形象;掃描式電子顯微鏡可用以觀察立體的表面,放大倍率約20萬倍。
電子顯微鏡分為透射電子顯微鏡、能量過濾透過式電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、場發(fā)射掃描電子顯微鏡、掃描透射電子顯微鏡等類型。從20世紀50年代開始,研究者們應用電子顯微鏡相繼取得了很多重要成就,可以說,電子顯微鏡的出現(xiàn)大大推動了人類的科學研究,特別是新興的數(shù)碼成像技術更是把顯微攝影技術推向了一個新高峰,使顯微科學與數(shù)字技術的發(fā)展牢固地結合起來,為人類的科學發(fā)展做出了重大貢獻。
低溫電子顯微鏡重振結構生物學領域研究
低溫電子顯微鏡(cryo-EM)雖然是結構生物學研究中的重要工具,但其潛力還未充分發(fā)揮出來。近期的技術進步大大提高了cryo-EM的分辨率,正在重振這一領域。在單粒子cryo-EM實驗中,大分子集合體被冷凍在一層薄薄的冰中,并用電子顯微鏡成像。單個集合體的數(shù)千至數(shù)百萬幅圖像必須經(jīng)過計算機比對和合并,以獲得一個三維結構。
與X射線晶體衍射相比,cryo-EM的一個明顯優(yōu)勢就是不需要結晶,這大大拓寬了其研究領域,使生物大分子及其復合物的構象研究成為可能。運用這種方法,一些生物樣品如病毒和大腸桿菌70S核糖體的三維重構圖已經(jīng)得到,但分辨率不是很高。
而最近英國分子生物學MRC實驗室(MRC Laboratory of Molecular Biology)的科學家,他們使用單個粒子降臨的cryo-EM研究酵母線粒體核糖體大亞單元的結構,0.32 nm分辨率能夠使其在接近原子水平給出一個近乎完整的三維構型圖像,其包括了39種蛋白質(zhì),其中有13中蛋白質(zhì)是線粒體獨有的,而且還有擴張的線粒體多糖體RNA(mitoribosomal RNA)片段。得到如此龐大的(3 MD即3-megadalton)生物機器近原子水平的圖像,既不需要蛋白質(zhì)結晶,也不需要廣泛凈化,所以這種分析方法被認為在電子顯微鏡發(fā)展史上具有里程碑意義。
這種核糖體在真核線粒體(eukaryotic mitochondria)中發(fā)現(xiàn)。它不同于酵母細胞質(zhì)中的核糖體和其他真核生物細胞中的核糖體,也不同于細菌核糖體。由2009年諾貝爾化學獎得主萬卡特拉曼?萊馬克里斯南(Venkatraman Ramakrishnan)、托馬斯?施泰茨(Thomas A. Steitz)和阿達?尤納斯(Ada E. Yonath)曾經(jīng)得到了核糖體三維X-射線晶體結構。新的分辨率在0.32nm的線粒體核糖體結構是由萬卡特拉曼?萊馬克里斯南等人合作完成。