熒光定量PCR(qPCR)是以熒光為基礎(chǔ)的定量分析技術(shù)，應(yīng)用非常廣泛，可以用于定量RNA豐度(RT-qPCR)，驗(yàn)證芯片或測序的數(shù)據(jù)，確定病原體的載量，進(jìn)行基因分型等等。 

　　熒光定量PCR儀負(fù)責(zé)監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化，記錄檢測熒光達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(被稱為Ct或Cq值)。從理論上說，每一個(gè)qPCR循環(huán)會使目標(biāo)序列翻倍，因此人們可以在Ct值的基礎(chǔ)上對樣本進(jìn)行定量。

　　在進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)，我們往往會面臨眾多選擇，每一步選擇都影響著實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果。好在市面上的qPCR產(chǎn)品也種類繁多，可以滿足我們的各種需求。

　　染料法VS探針法

　　熒光定量PCR主要分為染料法和探針法兩種。染料法一般采用DNA染料SYP® Green(或Promega的PYT® Green等)，這種方法不僅使用簡單，成本也最低。不過染料法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA，不具有序列特異性。為此，一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標(biāo)準(zhǔn)，用來校正背景。

　　染料法

　　成本低是染料法qPCR的一個(gè)主要優(yōu)勢，DNA染料相對比較便宜，而且適用于任何序列。不過染料法無法在同一個(gè)樣本中檢測多個(gè)指標(biāo)，也難以鑒定擴(kuò)增得到的序列，會受到脫靶效應(yīng)(如引物二聚體)的影響。在這種情況下，就需要進(jìn)行熔解曲線分析，判斷擴(kuò)增所得產(chǎn)物是否只有一種。

　　據(jù)安捷倫的Surekha Karudapuram介紹，熔解曲線分析能夠幫助研究者確定擴(kuò)增的特異性。她還指出，理論上利用熔解曲線也可以進(jìn)行多染料的反應(yīng)，甚至可以粗略定量那些峰值。

　　市面上可供選擇的染料法master mix非常多，例如：安捷倫的Pilliant III Ultra-Fast SYP® Green QPCR & QRT-PCR master mixes，Bio-Rad的SsoAdvanced™ SYP® Green Supermix，Life Technologies的SYP® Select Master Mix，Promega的GoTaq® qPCR Master Mix，Qiagen的Type-it CNV SYP Green PCR Kits，羅氏的FastStart SYP Green Master，Sigma-Aldrich的KiCqStart® SYP® Green qPCR ReadyMix™，以及Thermo的Luminaris Color HiGreen High ROX qPCR Master Mix等等。

　　TaqMan探針

　　探針法qPCR使用具有序列特異性的熒光寡核苷酸探針。目前最常用的是Life Technologies公司的TaqMan®探針，該探針5’端連有熒光基團(tuán)，3’端連有淬滅基團(tuán)。在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針與正反向引物之間的模板結(jié)合，當(dāng)聚合酶到達(dá)探針處時(shí)，酶的5’-3’外切活性將熒光基團(tuán)切下，使其脫離淬滅基團(tuán)，發(fā)出熒光。

　　探針法與染料法的最大區(qū)別在于，理論上探針法中的熒光信號只來源于目標(biāo)序列。此外，人們還可以利用不同探針，在一個(gè)體系中同時(shí)檢測多種指標(biāo)。

　　市面上的探針法master mixes也是琳瑯滿目，包括：安捷倫的Pilliant III Ultra-Fast QPCR & QRT-PCR Master Mixes，Bio-Rad的SsoFast Probes Supermix，Life Technologies的TaqMan Fast Advanced Master Mix，Promega的GoTaq Probe qPCR Master Mix，Qiagen的Type-it CNV Probe PCR +qC Kit，羅氏的FastStart TaqMan Probe Master，以及Thermo的DyNAmo ColorFlash Probe qPCR Kit等等。

　　據(jù)估計(jì)，SYP Green或TaqMan的使用者占qPCR用戶總數(shù)的80-90%，其他用戶采用的也基本上是上述兩種方法的變種，例如分子信標(biāo)和Scorpion®探針。

　　其他探針

　　分子信標(biāo)是一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針，兩頭分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。與TaqMan一樣，分子信標(biāo)的序列也與擴(kuò)增引物之間的模板互補(bǔ)。在退火階段，這種探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)展開與模板結(jié)合，這時(shí)熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，發(fā)出與模板豐度相對應(yīng)的熒光信號。Scorpion探針將分子信標(biāo)與PCR引物結(jié)合起來，在擴(kuò)增階段引物延伸形成PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物中的序列能夠與探針互補(bǔ)結(jié)合，使探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，發(fā)出熒光。

　　此外，Promega還開發(fā)了一種新型的Plexor® qPCR系統(tǒng)。在Plexor系統(tǒng)中，引物含有經(jīng)修飾的核苷酸(iso-dC)和熒光基團(tuán)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，DNA聚合酶會向DNA鏈中引入熒光淬滅基團(tuán)，使體系中的熒光逐漸減弱。其他qPCR方法記錄熒光的增強(qiáng)，而Plexor記錄的是熒光的衰減，Promega的市場經(jīng)理Gapiela Saldanha解釋道。

　　據(jù)Saldanha介紹，Plexor將探針法的序列特異性，與染料法的熔解曲線分析結(jié)合起來?！澳憧梢则?yàn)證目標(biāo)擴(kuò)增的特異性，”她說。此外，Plexor檢測不同靶序列只需要兩種引物，使多重分析的設(shè)計(jì)更為容易。

　　基因表達(dá)分析

　　從SNP分型、拷貝數(shù)分析到病原菌檢測，qPCR應(yīng)用范圍非常廣，不過最常見的是用qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析。基因表達(dá)分析往往需要定量樣本中的特定RNA，例如mRNA、microRNA、或長非編碼轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)行這樣的分析，首先要將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢詳U(kuò)增的DNA，進(jìn)行cDNA合成。

　　RT-qPCR試劑盒主要分為一步法和兩步法。一步法試劑盒將cDNA合成與qPCR合并為一步，速度更快，也更適用于自動化流程。兩步法雖然需要進(jìn)行兩次反應(yīng)，但反應(yīng)的效率更高，而且可以允許用戶保留cDNA樣本，能夠在一個(gè)RNA樣本中檢測多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。

　　“兩步法(qPCR)更有優(yōu)勢，其cDNA合成和qPCR反應(yīng)的效率更高，”Saldanha說。安捷倫，Bio-Rad，Life Technologies，Promega，羅氏和Qiagen都提供有相應(yīng)的RT-qPCR試劑盒。

　　樣本的挑戰(zhàn)

　　熒光定量PCR結(jié)果的好壞往往取決于核酸制備的質(zhì)量。處理環(huán)境樣本(如土壤)和植物樣本比較困難，因?yàn)槠渲型幸种芇CR反應(yīng)的物質(zhì)。此外，F(xiàn)FPE樣本也較難處理，其中不僅有PCR抑制劑，樣本中的核酸可能也遭到了降解。

　　“這種情況對于靈敏度要求較高，因?yàn)槟０辶糠浅Ｉ??！盞arudapuram說，“需要提取更純的核酸，并且使用能擴(kuò)增少量初始模板的master mix?！蔽覀兛梢赃x用進(jìn)行了相應(yīng)優(yōu)化的核酸提取試劑盒，例如Promega的ReliaPrep™ FFPE RNA Miniprep System或者Life Technologies的Plant RNA Reagent等等。

　　選擇理想的qPCR擴(kuò)增引物，也是一個(gè)不容忽視的問題。專家認(rèn)為，對于相同基因的檢測，最好采用已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化了的引物。目前，不少供應(yīng)商都為研究者們準(zhǔn)備了預(yù)先設(shè)計(jì)好的qPCR文庫，例如Sigma-Aldrich公司就制備了人類、小鼠、大鼠和斑馬魚的文庫。此外，Qiagen，Life Technologies，和Thermo等公司也提供有類似的工具。

　　qPCR儀與數(shù)字PCR

　　從本質(zhì)上來講，熒光定量PCR儀就是PCR儀與熒光檢測儀的結(jié)合，用于記錄qPCR反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。市面上的qPCR儀主要有以下幾種：安捷倫的Mx3000P qPCR System，Bio-Rad的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System，Illumina的Eco Real-Time PCR System，Life Technologies的QuantStudio™ 12K Flex System，Qiagen的Rotor-Gene Q，羅氏的LightCycler® systems，以及Thermo的PikoReal Real-Time PCR System等。

　　熒光定量PCR已經(jīng)是一個(gè)相當(dāng)成熟的技術(shù)了，不過當(dāng)樣本間的絕對差異較小時(shí)，qPCR檢測的效果并不那么理想。例如，qPCR很難區(qū)分一個(gè)基因兩拷貝和三拷貝之間的差異。好在，能夠進(jìn)行絕對定量的數(shù)字PCR技術(shù)誕生了。

　　數(shù)字PCR將樣本分為許多份，使每一份包含零或一個(gè)拷貝的模板。然后在每一份樣本中運(yùn)行qPCR反應(yīng)，對呈陽性的孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，以此確定樣本中模板分子的絕對數(shù)量。這一技術(shù)的精確性非常高，可以區(qū)分很小的拷貝數(shù)差異。Bio-Rad、Fluidigm、Life Technologies和RainDance是目前幾家主要的數(shù)字PCR廠商。