病理學(xué)技術(shù)（組織標(biāo)本切片和染色技術(shù)）是組織學(xué)、病理學(xué)等學(xué)科用于觀察和研究組織與細胞的正常形態(tài)及病理變化的常用方法。 

組織經(jīng)過固定、切片和染色后，光波通過被檢組織成分時，波長和振幅發(fā)生改變，在顯微鏡下能清晰的觀察其組織結(jié)構(gòu)，稱之為光鏡標(biāo)本的基本制作方法或稱為組織制片技術(shù)。 

目的生物學(xué)標(biāo)本在生活狀態(tài)下多為無色透明，而且組織一旦離開機體后很快就會死亡，其結(jié)構(gòu)就會失去正常狀態(tài)。必須對組織采取固定、切片和染色措施！ 

根據(jù)所使用支持物質(zhì)的不同，切片方法分為：

組織切片的主要程序： 

取材、固定→脫水→透明、浸透→包埋、切片→貼片、染色→浸洗→脫水→透明→封固。 

來源：臨床活體檢查，手術(shù)切除，病理解剖，實驗動物等 

要求：

1、根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵蠹安∽兂潭群侠砣〉媒M織材料。

2、取材的過程迅速、準(zhǔn)確 

組織取材注意事項

固定的目的： 

1）防止標(biāo)本的自溶與腐敗，以保持組織細胞的固有形態(tài)。 

2）使組織細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種物質(zhì)成份沉淀或凝固成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。 

3）可增強染色的作用。使組織中的各種物質(zhì)沉淀凝固而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。 

4）固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，增加組織硬度，便于制片。 

5）防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。另外，對某些具有傳染性的標(biāo)本，能防止疾病的擴散。

固定的方法： 

物理方法

干燥：血涂片

高熱：細菌涂片

低溫驟冷

化學(xué)方法

使用化學(xué)試劑配制成固定液固定 

影響固定的因素：

1 .組織固定必須新鮮：無論取人體或動物組織，都必須立即投入固定劑。

2.防止組織因固定劑的作用而發(fā)生變形。

3.標(biāo)本大?。涸诒ＷC形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的同時，厚度不超過5mm。

4.固定液的量：一般為組織塊體積的20-30倍（不得少于標(biāo)本體積的5倍）。

5.固定時間：根據(jù)組織的種類、大小，固定劑種類、性質(zhì)、滲透力的強弱而定。

6.固定溫度：室溫（20-25℃）或低溫（如4℃），一般不應(yīng)超過40-45 ℃。

7.選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?/span>

8.促使固定 

注意事項：

免疫組化固定方法的原則是：在保持細胞形態(tài)完好和所測抗原的前提下，應(yīng)選用濃度最低的固定液和最短的固定時間。為此，固定組織時應(yīng)該： 

1）組織新鮮，盡早、盡快固定。

2）組織塊盡量小。

3）固定后充分水洗，減少固定液造成的人工假象。

 4）針對抗原、染色法選擇最佳的固定方法 。 

常用的固定劑： 

1）10%福爾馬林緩沖液（pH7.4）

2）4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）

3）Bouin液

4）Zamboni’s液 

5）丙酮 

6）95%乙醇 

?7）A-F液

定義：

利用某種化學(xué)試劑逐步將標(biāo)本內(nèi)部吸收的水分置換出來，以使標(biāo)本處于無水狀態(tài)，這一過程叫脫水。

目的和原則

1有利于標(biāo)本的下一步處理，即透明、浸透、包埋

?2有利于切片的操作

3有利于標(biāo)本的長久保存 

常用的脫水劑：

1.單純脫水劑：如乙醇、丙酮和甲醇

2.脫水兼透明劑：如正丁醇、叔丁醇等

注意事項：

脫水時必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑，經(jīng)過各級濃度的脫水劑使其所含的水分逐漸減少而代之以脫水劑。防止組織過度收縮變形，或脫水不完全而影響制片效果。

1）組織取材3mm厚度，固定于福爾馬林?jǐn)?shù)小時后再換以新鮮福爾馬林固定數(shù)小時。

2）組織流水沖洗6-12h。 

3）70％酒精2-4h。

4）80％酒精2-4h。

5）90％酒精2-4h。

6）95％酒精（Ⅰ、Ⅱ）2-4h。

7）100％酒精（Ⅰ、Ⅱ ）1-2h。

8）二甲苯（Ⅰ）5-30min。

9）(二甲苯（Ⅱ） 5-30min)。

10）浸蠟（Ⅰ、Ⅱ ）2h。

11）組織包埋 

石蠟切片法

優(yōu)點:

缺點：

冰凍切片法

優(yōu)點：

缺點：

染色的目的：將標(biāo)本切片浸于染色劑內(nèi)，經(jīng)一定的時間，使組織或細胞及其他的成分被染上不同的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，便于在光鏡下進行觀察。 

普通染色：最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色，又稱常規(guī)染色。

特殊染色：為顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分。

復(fù)染色：襯托主染色所進行的染色。

常用的染色方法 

一）蘇木精（素）：是現(xiàn)今最常用、最有價值的常規(guī)細胞核染色劑，習(xí)慣上稱蘇木精是堿性染料 

二）伊紅：是一種胞漿較理想的染色劑。常用伊紅Y。酸性染料組織成分呈彌漫性染色。

1） 脫蠟至水 

①二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5-10min②100%乙醇 （5～10）min×2或3次③依次95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5～10min④蒸餾水浸洗 2～5min

2）蘇木精染色

① 蘇木精1-10min。② 自來水流水沖洗。③ 0.5%鹽酸-乙醇分色，數(shù)秒-數(shù)十秒。自來水快洗。 

④ 0.5%氨水藍化，30sec-1min，自來水沖洗⑤ 光鏡下鏡檢細胞核分色程度。⑥ 自來水流水沖洗3min。 

3）伊紅染色 

① 1%伊紅1-10min。② 蒸餾水快洗。 

脫水、透明和封固

① 70%、80%、90%乙醇速洗，每級數(shù)秒-數(shù)十秒。② 95%30sec-1min.光鏡下監(jiān)控細胞核與細胞質(zhì)顏色對比。 ③ 100%乙醇，3-5min，2次。④ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ,各5-10min。⑤ 封片:中性樹膠

組織化學(xué)（histochemistry)或細胞化學(xué)（cytochemistry）：是基于已知的化學(xué)反應(yīng)，在組織或細胞原位上顯示出組織或細胞中的化學(xué)物質(zhì)，并研究其化學(xué)性質(zhì)及功能關(guān)系的一門技術(shù)。是在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上，研究組織或細胞中化學(xué)物質(zhì)的形態(tài)、化學(xué)成分及定位、定量和代謝狀態(tài)的學(xué)科。

組織化學(xué)的特征：應(yīng)用物理的和化學(xué)的方法來查明細胞或組織的化學(xué)成分； 用組織學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)原理，研究細胞或組織的結(jié)構(gòu)、功能與化學(xué)的關(guān)系； 對細胞或組織成分的定位、定性、定量的特征進行研究，來認(rèn)識細胞或組織結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。具有較強的特異性。 

為了能在完好的結(jié)構(gòu)上同時顯示其化學(xué)物質(zhì)，組織化學(xué)技術(shù)必須做到：

（1）保存組織（細胞）在生活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)；

（2）保存組織（細胞）內(nèi)的生前化學(xué)成分、酶活性及檢測目的物；

（3）所使用的染色方法是按照已知的化學(xué)或物理反應(yīng)原理進行。

（4）反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)在組織結(jié)構(gòu)上形成穩(wěn)定的有色沉淀物質(zhì)。

（5）檢測手段要有高度的敏感性、特異性和可重復(fù)性。

（6）生成物的反應(yīng)產(chǎn)物必須在原位沉淀，保證定位的精確性及穩(wěn)定性。

組織（細胞）化學(xué)基本步驟冰凍切片或石蠟切片等常規(guī)處理后，再進行組織（細胞）化學(xué)染色，在光鏡下觀察。 

純化學(xué)方法：Schiff反應(yīng)法、偶氮偶聯(lián)法、金屬沉淀法、聯(lián)苯胺反應(yīng)、四唑鹽反應(yīng) 

類化學(xué)方法：屬某些特殊染色技術(shù)，如：Best洋紅染色 顯示糖原，Baker酸性蘇木精染色 顯示磷脂，Mayer黏洋紅與黏蘇木素 顯示黏蛋白 

物理學(xué)方法：1）脂溶染色法2）熒光分析3）放射自顯影 物理化學(xué)方法等

糖類物質(zhì)的顯示方法： 

PAS顯示法（Periodic Acid Schiff） 阿利新藍法（Alcian Blue） 阿利新藍-PAS復(fù)合法（Alcian Blue-PAS） 胭脂卡紅法（Carmine method） 甲苯胺藍法 硫堇法等。

蛋白質(zhì)顯示方法：

1、pH4.2以下的酸性溶液中，用堅牢綠、溴酚藍、麗春紅-2R等酸性染料染色，出現(xiàn)陽性結(jié)果表明有蛋白質(zhì)存在

2、在pH8.0以上的堿性溶液中，用酸性染料染色，呈陽性結(jié)果表明含堿性蛋白質(zhì)

3、若第2步為陰性結(jié)果，則改在酸性溶液中用堿性染料（亞甲基藍）染色。

核酸顯示：1、顯示DNA ： Feulgen法試劑：Schiff試劑、鹽酸、亞硫酸氫鈉 2、核仁組成區(qū)和酸性粘多糖復(fù)合顯示法：試劑：2%的甲酸、2%的明膠、50%的硝酸銀、阿申藍（8GX）、醋酸溶液3、粘多糖和核仁組成區(qū)雙染法試劑：Schiff氏試劑、膠性銀液 4、RNA和DNA的甲綠-派若寧顯示法試劑：甲綠、派若寧。 

酶組織（細胞）化學(xué)：用組織（細胞）化學(xué)方法顯示酶在組織或細胞內(nèi)的定位的技術(shù)。

常用的方法：酸性磷酸酶  堿性磷酸酶  三磷酸腺苷酶  乙酰膽堿酯酶  細胞色素氧化酶 一氧化氮合酶

影響酶活性的因素： 

1 、溫度：大部分酶反應(yīng)的合適溫度為37℃。

2、 pH： 酶有適合酶反應(yīng)速度的pH(大部分為7.0) 

3、抑制劑 能使酶活性降低的物質(zhì)

4、激活劑 能使酶活性增高的化學(xué)物質(zhì)

5、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響