立體顯微鏡通常被稱為實驗室或生產(chǎn)部門的主力。選擇立體顯微鏡時，需要考慮哪些因素呢？ 答案是：“看情況”。這是為什么呢? 因為它取決于用途，取決于用戶想要完成的任務。立體顯微鏡基本上是一種工具，用于將三維目標在三個維度中放大。 不同于復式顯微鏡，立體顯微鏡能夠應付這個任務。

背景知識

格里諾和 Cycloptic®原理

過去的雙目顯微鏡，其特點是透鏡系統(tǒng)簡單，而且設計和傳統(tǒng)的復式顯微鏡相同。 此類解剖顯微鏡，正如當時所熟知的那樣，主要用于生物學中的解剖用途；當時沒有技術上的應用。大約在 1890 年，美國生物學家和動物學家霍雷肖•S•格里諾（Horatio S. Greenough）采用了一項設計原理，今天仍為光學儀器的所有主要制造商所使用。“格里諾原理”基礎上的立體顯微鏡，實現(xiàn)了真正的高質量立體圖像。

1957 年，美國光學公司采用了帶有共用主物鏡的現(xiàn)代立體顯微鏡設計，并命名為Cycloptic®。它的現(xiàn)代鋁外殼下，是兩道平行的光束的路徑和主物鏡，以及一個五步變倍器。此種立體顯微鏡，制造商除采用格里諾原理外，還采用望遠鏡或 CMO（普通主物鏡）原理，并用于模塊化的、高性能的儀器。兩年后，另一家美國公司博士倫提出了 StereoZoom® 格里諾設計，作出了開創(chuàng)性的創(chuàng)新： 一步到位的變倍器（變焦）。 今天幾乎所有的設計都是基于一個變焦系統(tǒng)。

（左）：Cycloptic®，基于望遠鏡原理的第一臺立體顯微鏡圖 2a、b （右）：立體顯微鏡的兩種基本原理。a：望遠鏡或 CMO 原理 b：格里諾原理。

立體顯微鏡的選擇標準

時至今日，立體顯微鏡仍基于提到的技術方法——格里諾或 CMO 原理。

四個事項需要仔細評估：

a）用途是什么？
b）哪種結構需要觀察、記錄或可視化？
c）有多少人在使用顯微鏡？
d）解決方案的可用預算是多少？

一旦上述因素已知，則可以歸結為以下標準。

放大倍數(shù)、變焦范圍和物場

景深和數(shù)值孔徑

光學質量和工作距離

人體工學

照明

放大倍數(shù)、變焦范圍和物場

立體顯微鏡的總放大倍數(shù)，是變倍器、物鏡和目鏡的放大倍數(shù)的組合。

變倍器或變焦體

像放大鏡一樣，變倍器由光學透鏡構成，可以用來改變儀器的放大倍數(shù)。改變變倍器的位置，會改變圖像放大的程度。圖像放大的程度稱為放大倍數(shù)。現(xiàn)代立體顯微鏡能夠提供 16 倍放大（只有變焦體），20.5:1 的變焦范圍，其特點是能夠進行可靠測量的機動化或編碼。

接下來，圖像通過目鏡得到進一步放大。為找出目鏡中觀察到的目標的放大程度，用戶必須將變倍器和目鏡的放大倍數(shù)相乘。

然而為了保證完整性，提供公式如下：

MTOT VIS 為我們要計算的放大倍數(shù)。 VIS 代表“視覺”。

z 是變倍器的等級。

ME 為目鏡的放大倍數(shù)。
MO 為主物鏡的放大倍數(shù)（當格里諾系統(tǒng)中未使用輔助透鏡時為 1 倍）

物場

當從適當?shù)木嚯x向目鏡中觀察、而且瞳孔間距設置正確時，可以看到稱為物場的一個圓形區(qū)域。 物場的直徑根據(jù)放大倍數(shù)而變化。換言之，放大倍數(shù)和物場直徑之間存在著數(shù)學關系。 10 倍目鏡提供的物場數(shù)是23。這意味著變焦體和主物鏡放大 1 倍時，物場大小為23mm。 3 倍放大時物場減少到三分之一，即物場的直徑僅有7.66mm。

景深和數(shù)值孔徑

在顯微鏡中，景深往往被視為一種經(jīng)驗參數(shù)。 實際上它是由數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍數(shù)之間的相關性確定的。為了得到最佳視覺印象，現(xiàn)代顯微鏡的調(diào)整設施會在景深和分辨率——在理論上具有負相關性的兩個參數(shù)——之間產(chǎn)生一種最佳平衡。

視覺景深的實際價值

在視感景深這個問題上，Max Berek 是第一位發(fā)表觀點的作者，早在 1927 年他就發(fā)表了經(jīng)過大量實驗得來的結果。Berek 公式給出了視覺景深的實際值，因此今天仍然使用。

其簡化形式如下：

TVIS：視感景深

n：目標位于其上的介質的折射率。 如果目標被移開，則在公式中輸入介質的折射率，該介質形成變化的工作距離。

λ：使用的光的波長，對白光來說，λ = 0.55μm

NA：目標一側的數(shù)值孔徑

MTOT VIS：顯微鏡的視覺總放大倍數(shù)

如果以上方程中，視覺總放大倍數(shù)為有效放大倍數(shù)所取代（MTOTVIS = 500 - 1000 x NA），則可以看出，景深的第一個近似值與數(shù)值孔徑的平方成反比。

特別是放大倍數(shù)較低時，景深可以通過縮小鏡頭光圈（即減少數(shù)值孔徑）顯著增加。 這通常是通過光圈或一共軛平面上的光圈完成的。然而，數(shù)值孔徑越小時，橫向分辨率就越低。

因此問題是找到分辨率與景深（取決于目標結構）之間的最佳平衡。在立體顯微鏡中，為了更高的景深，常常需要做出一定的妥協(xié)，因為三維結構的 z 值經(jīng)常有此要求。

帶景深的格里諾立體顯微鏡的目標平面

更多景深——FusionOpticsTM

FusionOptics™是一種復雜的光學方法，能夠消除立體顯微鏡中分辨率和景深之間的關系。在這里，光路之一為觀察者的一只眼睛提供了高分辨率和低景深的一副圖像。通過第二光路，另一只眼睛看到相同目標的低分辨率和高景深的圖像。人類大腦會將兩個獨立的圖像組合成一個最佳整體圖像，其特點是分辨率高和景深高。

另一個說明人類大腦非凡能力的例子是格里諾立體顯微鏡。在這里，左右光路的目標平面彼此形成一個微小的角度。在整體圖像中，產(chǎn)生的整個區(qū)域似乎顯得清晰,盡管左邊或右邊的圖像并非如此。

現(xiàn)代立體顯微鏡，其特點是 20.5:1 變焦范圍、APO 校正光學系統(tǒng)和 FusionOptics™。

光學質量

立體顯微鏡的光學質量通常列為 Achro 或 Achromat（消色差），以及 Apo（復消色差），代表球形和色差的最高程度的校正。場曲率校正縮寫為 Plan，而 PlanApo 是色差和場曲率校正的組合。

Achro, Achromat：消色差校正

Plan：平場光學校正

PlanApo：復消色差和平場校正

色差是什么?

在立體顯微鏡等光學儀器中，色差是一種失真，鏡頭無法將所有顏色集中到同一個會聚點。這是因為鏡頭對不同波長的光有不同的折射率(透鏡的色散)。折射率隨著波長的增加而減少。良好的光學設計的目的，是減少或完全消除此種影響。

消色差透鏡是一種旨在限制色差和球面像差的影響的透鏡。消色差透鏡經(jīng)過校正后，將兩種波長（通常為紅色和藍色）聚焦到同一個平面上。此類透鏡或顯微鏡用于以下任務，即無需顏色復現(xiàn)和主要是評估幾何特性。另一方面，復消色差透鏡旨在較正三種波長（紅、綠和藍色），將它們聚焦到同一個平面上。工作距離

這是標本聚焦時，物鏡前鏡頭和和標本頂部之間的距離。在大多數(shù)情況下，物鏡的工作距離隨著放大倍數(shù)增加而減少。在立體顯微鏡中，工作距離是最重要的標準之一，因為它直接影響著顯微鏡作為工具的可用性。

人體工學鏡筒——身體和頭部放松，手臂有舒適支撐，腿部有足夠空間，并充分利用椅子。

人體工學——千人千樣

人有高有矮，這使得儀器需求成為個人問題。例如，為一定的任務配備的顯微鏡，有配件和特定的工作距離，其現(xiàn)有高度可能相當不適合特定的用戶。如果觀察高度過低，觀察者在工作時將被迫向前彎曲，導致頸部肌肉緊張。因此在理想狀態(tài)下，顯微鏡的觀察高度和視角，應根據(jù)用戶的體形調(diào)整。此外，可變的觀察高度，是用來防止完全久坐不動的姿勢的最佳方法。它允許觀察者采用個人坐姿，并按照自然的沖動周期性地改變，以便不時左右移位。的確，椅子的高度可以改變，這樣一種放松、微微彎曲的姿勢代替了之前的正襟危坐，但這不是最佳方法。更簡單、更舒適的方法是使用一種可變的雙目鏡筒，以彌補身高的差異。

由于采用了模塊化產(chǎn)品的方法，帶有 CMO 設計的立體顯微鏡可以根據(jù)用戶的尺碼或工作習慣提供的多種方式定制儀器，因而是首選方案。

照 明

在立體顯微鏡中，照明是將所有的工作暴露在光線下的關鍵。正確的照明將僅僅通過改變光的類型，便使所需的結構可視化，或有關樣品的新信息被發(fā)現(xiàn)。重要的是，將照明正確地匹配到正確的顯微鏡和正確的用途上。

現(xiàn)代立體顯微鏡照明系統(tǒng)基于持久的發(fā)光二極管，并提供獨特的方式，將解決方案整合到整個顯微鏡系統(tǒng)。高度整合的環(huán)形光源和使用中的偏振器，是為了減少標本上的眩光。

照明類型

入射

入射光主要用于不透明的標本。此種光（環(huán)形光、射燈等）的實現(xiàn)方法將取決于標本紋理和使用需求。入射光為各種各樣不透明的標本所需要。根據(jù)標本紋理和結果目標，入射照明方案的一種折衷選擇是可用的。

透射光

透射光對于各種透明標本很理想，范圍從生物樣品（如生物模型）到聚合物。

標準透射明視野照明

標準透射明視野照明用于所有類型的透明標本，其具有高對比度和足夠的顏色信

斜透射照明

此種照明技術用于幾乎透明、無色的標本。由于照明的斜位置，可以實現(xiàn)標本更大的對比度和視覺清晰度。

暗視場照明

立體顯微鏡中的暗視場觀察，需要一個包括反射鏡和遮光板的特制的臺子，以便將一個倒置的照明空心錐體以傾斜角度向標本方向移動。暗視場照明的原理要素，對于立體顯微鏡和更傳統(tǒng)的復式顯微鏡是相同的，通常配有復雜的多鏡頭聚光鏡系統(tǒng)、或帶有特制內(nèi)鏡的聚光鏡，該內(nèi)鏡包含調(diào)整為特定幾何形狀的反射面。

清晰、透明標本的對比方法

Rottermann Contrast™ 是一種局部照明技術,其顯示亮度不同時折射率的改變。相位結構通常在正地形對比中表現(xiàn)為立體的、浮雕式的圖像（如山丘），而在倒轉地形對比中表現(xiàn)為凹進。此種技術提供了許多變量視圖，以此提取最大可能的信息量。

結 論