隨著生物分子在許多制藥公司藥物開發(fā)途徑中所占據(jù)的比例越來越大，人們越來越關(guān)心相關(guān)開發(fā)、生產(chǎn)與監(jiān)管方面難題的解決。由于藥物的潛在免疫原性是生產(chǎn)商和監(jiān)管者都十分關(guān)心的要素，因此如何定義生物藥品的純度與效力要比那些小分子藥物復(fù)雜得多。這反過來突顯了業(yè)界對高質(zhì)量分析工具的迫切需要——希望它們能有助于全面表征出生物藥物顆粒和團聚物，同時對藥物內(nèi)在顆粒與污染物的理化特性表征也越來越重視。
測量的用處何在？
藥物分子從發(fā)現(xiàn)走向早期配方是十分關(guān)鍵的一個步驟。分子的理化特性是藥物配方與給藥的決定因素；藥物分子的理化特性確定得越早，就能獲得越大的經(jīng)濟效益——無論是為了確定上述步驟成功的可能性，還是盡早避免可能的失敗。就這一點而言，比較理想的是能夠在非常少量的樣品上進行一系列非破壞性試驗，并且把更多的精力放在改善可能用到的測試過程中。
從藥物分子理化特性表征到藥物開發(fā)過程直至最終的成品測試，發(fā)現(xiàn)和檢測蛋白質(zhì)團聚物，是藥物開發(fā)最重要的步驟，因為理解藥物分子這方面的行為對于藥物產(chǎn)品的配制、穩(wěn)定性和安全性來說都是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是通過范德華力、氫鍵、二硫鍵和疏水作用的結(jié)合來保持的，環(huán)境條件的改變可能會影響其中的一些或者全部相互作用力——其結(jié)果可能會引發(fā)團聚物非正常的折疊或者對于溶解性造成負面影響。在此過程中，蛋白質(zhì)的活性常常會消失，也有可能很多團聚物會發(fā)展出免疫原性，從而對最終治療藥物產(chǎn)品的有效性和安全性造成顯著影響。
當前的監(jiān)管預(yù)期是，對團聚物和大小范圍在“0.2- 2”微米級別1的不溶性微粒進行表征。大小超過幾微米的團聚物可以用視覺方法來進行表征。小于這個尺寸的，可以采用動態(tài)光散射(DLS) 法和體積排除色譜 (SEC) 法等成熟的分析技術(shù)對蛋白質(zhì)凝聚物進行表征。圖1列出了上述方法所采用的技術(shù)和測量范圍。共振質(zhì)量測量法 (RMM)是最新發(fā)展的技術(shù)現(xiàn)在也被用來檢測和統(tǒng)計50 nm到5μm這一至關(guān)重要尺寸范圍內(nèi)的不溶性微粒，并對它們的浮力質(zhì)量、凈質(zhì)量和粒徑大小進行可靠的測量。共振質(zhì)量測量法為不溶性微粒和亞微米級凝聚物提供了測量窗口。
動態(tài)光散射法的使用
動態(tài)光散射法測量迅速，屬于非侵入性的測量方式，特別適合在藥物試劑開發(fā)的早期階段篩選蛋白質(zhì)。該技術(shù)測量了布朗運動下的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的散射光強度波動，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為尺寸與尺寸分布數(shù)據(jù)。這種技術(shù)最大的優(yōu)點之一是能夠在最早的階段對蛋白質(zhì)團聚物進行檢測，從而確定生成或者阻止蛋白質(zhì)形成團聚物的條件。
蛋白質(zhì)分析過程應(yīng)該選擇理想的動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)。當溶液中蛋白質(zhì)尺寸與散射光波長相比非常小時，散射光的強度不再取決于角度，也就是說從任何角度進行測量都會得出相同的結(jié)果。然而隨著蛋白質(zhì)尺寸增大并超過≈λ/ 10時，向前的散射光強度開始增加，此時，從合適的角度對數(shù)據(jù)進行收集就變得十分重要。例如，采用配有背向散射檢測技術(shù)的儀器，通過測量前后兩個方向 (見下列數(shù)據(jù))的散射光強可以對蛋白質(zhì)團聚過程進行有效的監(jiān)控。
應(yīng)用體積排除色譜法
體積排除色譜法 (SEC)，顧名思義，是利用分子在流體力學(xué)尺寸上的差異分離溶解的高分子。通常在生物科學(xué)實驗室會采用這種方法來表征純化和重組的蛋白質(zhì)。當使用SEC作為分析工具時，其得到的信息量和有效性取決于和色譜連接的檢測技術(shù)。
單檢測SEC采用紫外 (UV) 檢測儀來檢測濃度，依然是測試所有蛋白質(zhì)團聚物的傳統(tǒng)手段，但是功能更為強大的多檢測系統(tǒng)在這個應(yīng)用領(lǐng)域越來越受到人們的青睞，因為它們可以提供互補的信息和對檢測結(jié)果綜合解釋。例如，結(jié)合了示差折光檢測器(RI) 、紫外檢測器、光散射檢測器和粘度檢測器的系統(tǒng)可以對蛋白質(zhì)樣品進行全面表征，提供分子量數(shù)據(jù)以及詳細的結(jié)構(gòu)變化和特征，同時避免了色譜柱校準的需要。
圖3顯示了GPC /SEC色譜儀對牛血清蛋白樣本的檢測，上面顯示了由RI和光散射檢測器組成的系統(tǒng)所獲得的響應(yīng)。紅色為RI信號，在大約25毫升時反應(yīng)比較明顯，根據(jù)相應(yīng)光散射強度數(shù)據(jù) (綠色) 計算得到的分子量，可以確定是單體。較早出現(xiàn)的兩個流出峰，根據(jù)分子量可以確定為二聚體和三聚體。最早出現(xiàn)的峰值處所對應(yīng)的大量光散射信號表明，這些是團聚物。如果僅僅依靠單個RI/UV檢測器系統(tǒng)是對于所有組成進行準確的定性定量的檢測是不可能完成的。
引入共振質(zhì)量法測量
作為分析家族中相對較新的一員，共振質(zhì)量檢測方法 (RMM) 檢測并統(tǒng)計樣本中不溶性微粒與亞微米級微粒的數(shù)量，同時測量其粒度尺寸和質(zhì)量分布。由于RMM 是一種計數(shù)技術(shù)，上述質(zhì)量分布數(shù)據(jù)是在數(shù)字基礎(chǔ)上產(chǎn)生，因此賦予該技術(shù)對稀疏顆粒群很好的敏感性。
在共振質(zhì)量檢測儀的核心部位，有一個微機電系統(tǒng) (MEMS) 傳感器，傳感器內(nèi)含有微米級流通道的共振懸臂。當粒徑范圍為50 nm - 5μm的單個顆粒流過通道時，懸臂的諧振頻率會發(fā)生與顆粒浮力質(zhì)量相對應(yīng)的變化，由此可以從檢測到的頻率變化中推斷出顆粒的干燥質(zhì)量和粒徑。
與此同時，MEMS傳感器還能提供關(guān)于樣本濃度、粘度、密度和體積等信息，并能夠檢測和分辨相對于溶劑的正負浮力的顆粒。基于浮力正負的區(qū)分能力非常有用，比如他可以同時區(qū)分檢測被硅油液滴污染的樣品中的硅油成分和蛋白質(zhì)成分 (見圖4)。這是一個在藥物開發(fā)后期和生產(chǎn)中經(jīng)常會碰到的問題，因為在上述場合中硅油是藥物輸送的注射器經(jīng)常遇到的一種污染物。
共振質(zhì)量檢測法的另一個優(yōu)點是，那就是它架起了可見光法和溶液法 (如體積排除色譜法，較難測出蛋白質(zhì)團聚成都) 之間的橋梁。監(jiān)管機構(gòu)十分希望能對蛋白質(zhì)的團聚物加以可靠的量化和全面的認識，為了滿足上述的分析需求，共振質(zhì)譜法技術(shù)應(yīng)運而生，它可以貫穿質(zhì)量控制的整個過程，甚至在有常見污染物的情況下也能滿足分析需求。
展望未來
生物分子固有的復(fù)雜性和可變性對快速發(fā)展的生物制藥行業(yè)提出了諸多新挑戰(zhàn)。利用現(xiàn)有技術(shù)對成品中的蛋白質(zhì)顆?；驁F聚物進行檢測固然十分重要，但業(yè)界越來越需要各種有助于了解促進上述相互作用的理化機制、并對穩(wěn)定配方的開發(fā)起到支撐作用的測量技術(shù)。分析解決方案提供商必須跟上這樣的變化步伐，憑借側(cè)重于測量全新而又不斷出現(xiàn)的“品質(zhì)屬性”的儀器產(chǎn)品的快速開發(fā)，對行業(yè)需求作出預(yù)見和響應(yīng)。
參考資料
1 演講稿：Susan Kirshner，F(xiàn)DA 生物技術(shù)辦公室。下載地址：點擊下載
結(jié)語
位于美國賓夕法尼亞州的馬爾文儀器最近推出了一項全球生物科學(xué)發(fā)展項目。這是一個資源充足并且專注于高端技術(shù)合作開發(fā)的項目，與許多生物制藥公司和該領(lǐng)域內(nèi)聲名卓著的學(xué)術(shù)領(lǐng)導(dǎo)人合作。下面的方框里包含了項目的更多細節(jié)，如需進一步了解敬請與我們接洽。
圖1:業(yè)界需要一系列分析技術(shù)，確保對蛋白質(zhì)凝聚物所有可能的粒徑范圍進行準確測量
圖2: 對后方(173 度)和前方(12.8 度)的光散射強度同時進行測量，確保整個凝聚過程中的粒徑得到準確的測量。
圖3: 采用由RI 和光散射檢測儀組成的GPC/SEC 系統(tǒng)對牛血清蛋白進行測量。
圖4: 共振質(zhì)譜法(阿基米德，馬爾文儀器)對單個蛋白樣品進行了正浮力硅油液滴和負浮力蛋白質(zhì)凝聚顆粒兩種尺
寸分布進行測量。
（作者：Stephen Ball,，馬爾文儀器產(chǎn)品營銷經(jīng)理）
