Fluidigm 公司開(kāi)發(fā)了一種在C1^TM單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)及Biomark^TM HD系統(tǒng)上檢測(cè)單細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)方案。此方案可以在小于24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，平行處理96個(gè)單細(xì)胞，在一張GE 96.96芯片對(duì)每個(gè)單細(xì)胞分別檢測(cè)多達(dá)96種miRNA。配套的SINGuLAR™ 2.0分析軟件可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督式聚類分析及PCA分析，有效的根據(jù)miRNA表達(dá)類型在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞群體的異質(zhì)性，為研究miRNA調(diào)控提供更多數(shù)據(jù)。

 

 

Leyrat Anne, Shuga Joe, Li Nianzhen, Szpankowski Lukasz, Unger Marc & West Jay

（ISSCR 2013 poster: F-3201）

 

MicroRNA (miRNAs)是一類短?。?8-24個(gè)核苷酸）的非編碼RNA，它們可以通過(guò)破壞信使RNA（mRNA）的穩(wěn)定性和抑制mRNA翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。細(xì)胞群體中miRNA的表達(dá)通常認(rèn)為可以驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)和蛋白功能。我們的目的是使用一種微流控系統(tǒng)在單細(xì)胞水平確定miRNA表達(dá)的變化，這種系統(tǒng)可以自動(dòng)化的將單細(xì)胞捕獲及miRNA預(yù)擴(kuò)增以便進(jìn)行后續(xù)表達(dá)分析。我們開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、模塊化的流程，可以將對(duì)細(xì)胞群體的分析輕松降至單細(xì)胞水平（圖1）。此流程包括兩個(gè)核心部件：C1^TM單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)（圖1a：樣本制備，包括細(xì)胞分離和從miRNA制備cDNA）和動(dòng)態(tài)芯片（Dynamic Array™ IFC）及BiomarkTM HD系統(tǒng)（圖1b：讀出，高度平行的表達(dá)分析）。對(duì)C1^TM芯片捕獲的每個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行的目標(biāo)特異性擴(kuò)增（Specific Target Amplification, STA），借用了Single Cell-to-Ct™試劑盒(Life Technologies)完成裂解及預(yù)擴(kuò)增步驟，以及TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒(Life Technologies)完成逆轉(zhuǎn)錄步驟（圖2）。

 

使用動(dòng)態(tài)芯片及Biomark^TM HD系統(tǒng)，可以使用96對(duì)microRNA TaqMan表達(dá)引物，平行分析從96個(gè)單細(xì)胞預(yù)擴(kuò)增所得的96個(gè)cDNA樣本。使用Fluidigm SINGuLAR™ 2.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），揭示了從單一表型所得的一群?jiǎn)渭?xì)胞中miRNA表達(dá)的顯著變化（圖3,4,5）。比較不同表型的細(xì)胞群體（人類胚胎成纖維細(xì)胞，人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），從iPS所得人類神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC），以及完全分化的人類神經(jīng)元（HN）），除同一類細(xì)胞之間表達(dá)的異質(zhì)性外，展示了(不同類型細(xì)胞間)更巨大的差異。

圖1. 在單細(xì)胞進(jìn)行miRNA分析的整合流程
 

C1單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)使用Life Technologies 開(kāi)發(fā)的試劑和實(shí)驗(yàn)方法（“Single-cell MicroRNA expression analysis”），對(duì)單細(xì)胞中的miRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行目標(biāo)特異性擴(kuò)增（STA）。從將細(xì)胞懸液加至C1芯片到完成數(shù)據(jù)分析的整個(gè)流程，可以在不到24小時(shí)內(nèi)完成。

圖2. C1 MicroRNA STA實(shí)驗(yàn)流程
 

單細(xì)胞懸液（200-1000個(gè)細(xì)胞）被加入C1 IFC芯片的細(xì)胞進(jìn)樣孔。使用來(lái)自Single Cell-to-Ct™試劑盒(Life Technologies)的裂解和預(yù)擴(kuò)增試劑，以及來(lái)自TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒(Life Technologies)的逆轉(zhuǎn)錄試劑，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（使用Megaplex^TM RT pool）和預(yù)擴(kuò)增（使用Megaplex^TM PreAmp pool)，以便可以檢測(cè)每個(gè)單細(xì)胞中多達(dá)380種miRNA的表達(dá)。C1 IFC捕獲單細(xì)胞，然后沖洗，裂解，在反應(yīng)倉(cāng)平行對(duì)每個(gè)單細(xì)胞的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增。96個(gè)預(yù)擴(kuò)增過(guò)的樣本然后被導(dǎo)出，使用Biomark HD系統(tǒng)在一塊96.96動(dòng)態(tài)芯片運(yùn)行，研究每個(gè)樣本中多達(dá)96種miRNA的表達(dá)。

 

圖3. 分析：?jiǎn)蝹€(gè)iPS細(xì)胞及其NPC后裔

 

(A) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督式聚類分析可以清楚的區(qū)別開(kāi)iPS細(xì)胞及使用小分子從iPS獲得的NPC后裔¹. 同時(shí)揭示了每種細(xì)胞中的亞群。

(B) PCA清楚的揭示了這兩種表型不同的細(xì)胞群之間的差異。

(C) Violin Plot顯示了不同亞群中miRNA 的差異性表達(dá)，以及主成分1和2的主要貢獻(xiàn)者（左上至右下的順序）。iPS和NPC之間5種miRNA的表達(dá)變化，和使用microassay從胚胎干細(xì)胞（ES）及其NPC后裔得到的趨勢(shì)相同（未發(fā)表數(shù)據(jù)，Yao Shuyuan友情提供）。

 

圖4. 人類神經(jīng)元，iPS和NPC細(xì)胞

(A) 對(duì)從iPS，NPC和成熟神經(jīng)元（HN）獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督式聚類分析，可以清楚的將HN細(xì)胞從iPS和NPC細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，同時(shí)也揭示了每類細(xì)胞中存在的亞群。miR-9更頻繁且更高水平的在成熟神經(jīng)元（HN）中表達(dá)。

(B) 根據(jù)miRNA表達(dá)，PCA可以清楚的區(qū)分這三類細(xì)胞。miR-20a，19b，17，和106a在HN中表達(dá)水平較低，符合基于神經(jīng)分化和衰老數(shù)據(jù)的預(yù)期^2,3。

圖5. 不同傳代數(shù)的胚胎成纖維細(xì)胞

(A)  對(duì)從兩個(gè)不同傳代數(shù)（P13和P24）獲得的BJ胚胎成纖維細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督式聚類分析，雖然可以揭示不同細(xì)胞間miRNA表達(dá)類型的不同，卻無(wú)法區(qū)分這兩種群體。

(B)  對(duì)從P13和P24細(xì)胞得到的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，進(jìn)一步確認(rèn)無(wú)法根據(jù)miRNA表達(dá)區(qū)分這兩群細(xì)胞。

(C)  當(dāng)傳代數(shù)相距更遠(yuǎn)（P7 對(duì)P24），對(duì)miRNA數(shù)據(jù)（熱圖未顯示）進(jìn)行PCA分析可以區(qū)別他們。

 

·  我們?cè)贑1^TM單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)潔的實(shí)驗(yàn)方案，能以最少的手工操作，在不到24小時(shí)內(nèi)，平行處理高達(dá)96個(gè)單細(xì)胞，對(duì)其miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析。

·  C1 miRNA STA實(shí)驗(yàn)方案使用了Life Technologies為miRNA優(yōu)化過(guò)的試劑。特別的，Megaplex™ RT及PreAmp pool可以從C1 IFC上每個(gè)單細(xì)胞獲得多達(dá)380種不同miRNA的cDNA。使用Biomark系統(tǒng)，在96.96 GE動(dòng)態(tài)芯片可以讀出表達(dá)類型。

·  對(duì)來(lái)自不同類型細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督式聚類分析及PCA分析，揭示了不同類型細(xì)胞之間、或者同一類型細(xì)胞中miRNA表達(dá)類型的差異（被microarray或者文獻(xiàn)所證實(shí)）。

1.  Chambers SM, et al. (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27(3), 275-280.

2.  Trompeter H-I, Abbad H, Iwaniuk KM, Hafner M, Renwick N, et al. (2011) MicroRNAs MiR-17, MiR-20a, and MiR-106b Act in Concert to Modulate E2F Activity on Cell Cycle Arrest during Neuronal Lineage Differentiation of USSC. PLoS ONE 6(1): e16138. doi:10.1371/journal.pone.0016138

3.  Hackl M., Brunner S., Fortschegger M., Laschober G.T., Micutkova L., et al. (2010), miR-17, miR-19b, miR-20a, and miR-106a are down-regulated in human aging. Aging Cell, 9(2), 291-296.