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賽默飛發(fā)布下一代表征利器Orbitrap Eclipse?質(zhì)譜儀

   2019-06-27 賽默飛世爾科技(中國)有限公司1048
核心提示:賽默飛作為科研領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者,致力于解決分析難題,全能型Orbitrap Eclipse將簡單又復(fù)雜的生物制品質(zhì)譜表征帶入了Top/Middle-Dow
 
賽默飛作為科研領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者,致力于解決分析難題,全能型Orbitrap Eclipse™將“簡單又復(fù)雜”的生物制品質(zhì)譜表征帶入了“Top/Middle-Down時(shí)代”
 

 
1復(fù)雜生物制品的完整分子量測定——糖基化位點(diǎn)較多的融合蛋白類
 
得益于PTCR(質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少)技術(shù)、深度真空技術(shù)(氣壓可調(diào)0.5-20mTorr)。
 
單克隆抗體及ADC類蛋白樣品異質(zhì)性相對較低,在傳統(tǒng)的LC-MS/MS(變性反相色譜或非變性分子排組色譜條件)中能夠獲得高信噪比、高質(zhì)量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位點(diǎn)較多的融合蛋白類,如細(xì)胞因子融合蛋白,異質(zhì)性非常高,即使在非變性去唾液酸條件下仍舊無法有效區(qū)分每一成分(圖1A),通常的解決方式是使用各種糖苷酶去除不同種類糖型,降低譜圖復(fù)雜性,然而卻失去了樣品的完整水平糖型信息。
 

圖1. 細(xì)胞因子融合蛋白分子量測定; 1A. 去唾液酸后在native條件質(zhì)譜圖 1B.經(jīng)過PTCR反應(yīng)后質(zhì)譜圖 1C.經(jīng)BioPharma軟件去卷積后的各成分質(zhì)量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)
 
Orbitrap Eclipse™ 針對不同的樣品分析可調(diào)節(jié)IRM中氣壓,提高信號響應(yīng),以及PTCR強(qiáng)力的加持技術(shù)則可簡單快速的解決此類困擾已久的難題,如圖1所示,在圖1A中選擇帶多質(zhì)子且信號強(qiáng)度較高的m/z5677-5757范圍,經(jīng)PTCR反應(yīng)后降低質(zhì)子數(shù),從而降低各電荷態(tài)間的重疊度(圖1B),此時(shí)可清晰的分辨每一成分,BioPharma Finder軟件去卷積后獲得該融合蛋白主要成分的分子量(圖1C),為復(fù)雜生物制品的表征提供完整信息。
 
2非變性蛋白Top-Down分析
 
得益于ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技術(shù)、HMR?、PTCR技術(shù)
(全能型Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀集各種利器于一身)
 
對于做蛋白藥物質(zhì)譜表征分析的人來說,理想的狀態(tài)是使用快速簡單甚至無需樣品前處理,直接進(jìn)入LC-MS/MS或MS only對蛋白藥物進(jìn)行表征高效且降低樣品前處理引入的干擾,同時(shí)可直接對電荷變異體成分進(jìn)行快速的確證。而現(xiàn)實(shí)是由于抗體分子大,碎片離子少且復(fù)雜導(dǎo)致在完整蛋白水平獲得較低的序列覆蓋度,實(shí)用價(jià)值低。Orbitrap Eclipse™將非變性完整蛋白Top-Down分析推向嶄新的高度。
 
以Herceptin®抗體為例,溶液置換成50mM乙酸銨(Herceptin®濃度為2ug/uL),不經(jīng)LC通過注射泵直接進(jìn)入MS中,獲得高信噪比高質(zhì)量精度的一級譜圖(圖2),隔離豐度最高的母離子(+27價(jià))分別進(jìn)行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂,且使用Orbitrap 240,000分辨率進(jìn)行高準(zhǔn)確度二級碎片離子掃描,由于Orbitrap Eclipse™具有HMR?選項(xiàng),可在二級譜圖中看到m/z達(dá)8000的豐富碎片離子。
 

 
圖2.非變性Herceptin®高質(zhì)量精度的一級質(zhì)譜圖,不同碎裂模式下的二級質(zhì)譜圖
 

圖3. 經(jīng)BioPharma Finder解析后輕重鏈氨基酸序列覆蓋度
 
經(jīng)BioPharma Finder解析后,輕鏈氨基酸序列覆蓋度為57%,重鏈氨基酸序列覆蓋度為36%(圖3),碎片離子質(zhì)量偏差在3ppm以內(nèi),Orbitrap Eclipse™在非變性條件下Top-Down結(jié)果刷新了以往的記錄?¹?。
 
值得注意的是,PTCR技術(shù)不僅在復(fù)雜生物制品分子量測定中大顯身手,而且能夠顯著降低ETD MS²譜圖的復(fù)雜度(圖4),大大提高質(zhì)量碎片離子的解析度(圖5),從而提升Middle-Down氨基酸序列的覆蓋度(圖6)。
 

圖4.NIST mAb Fd亞基經(jīng)ETD碎裂以及PTCR反應(yīng)后的二級碎片離子質(zhì)譜圖
 

圖5.ETD only與ETD with PTCR二級/三級碎片離子鑒定分布圖
 

圖6.NIST標(biāo)準(zhǔn)抗體Middle-Down氨基酸序列覆蓋度
 
3基于以上獨(dú)特的優(yōu)勢性能,可進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域
 
如電荷變異體的快速鑒定;利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide復(fù)合物篩選高免疫原性疫苗時(shí),采用Orbitrap Eclipse™測定復(fù)合物的完整分子量和Top-Down,來評估多肽的交換(圖7);此外多種碎裂方式與超高分辨率Orbitrap的組合能夠更加準(zhǔn)確的對未知蛋白進(jìn)行從頭測序(De-novo sequencing)。
 

圖7.Orbitrap Eclipse™評估MHC與多肽的交換,助力高免疫原性疫苗的篩選(Data Courtesy :Genentech)
 
結(jié)語:目前Orbitrap Eclipse™是功能最為齊全的高分辨質(zhì)譜儀之一,旨在解決蛋白質(zhì)分析中極具挑戰(zhàn)的問題,持此利器定能推動(dòng)生物學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展。
 
至此,ASMS新品連載正式完結(jié)啦!快和賽默飛一起回顧下賽默飛2019新品質(zhì)譜的精彩瞬間~
 
賽默飛于ASMS 2019上發(fā)布的兩款新品質(zhì)譜再次刷新了Orbitrap的記錄——
 
全新一代Q Orbitrap旗艦機(jī) Orbitrap Exploris™480 質(zhì)譜儀,體積小巧但性能超強(qiáng),穩(wěn)定耐久。天才不“繁”,勢必將蛋白質(zhì)組學(xué),尤其是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究推向新的高度。
 
堪稱創(chuàng)新巔峰之作的全能型Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀,集各種高能軟硬件技術(shù)于一身,性能比尖,輕松應(yīng)對蛋白質(zhì)組學(xué),生物制藥與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析研究中的各項(xiàng)挑戰(zhàn)。
 
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